CRISPR文库全流程解析

阶段1： 文库构建：涉及文库中所有基因的sgRNA设计， sgRNA模板合成， sgRNA连接到特定的质粒模板构建文库质粒以及对构建成功的文库质粒进行质检。

阶段2：文库转导：大部分文库筛选实验都是通过慢病毒感染方法进行文库转导，所以该阶段涉及到文库慢病毒包装，包装好的文库病毒液以低MOI感染目的细胞，并根据文库病毒中的抗性进行阳性感染细胞筛选。

阶段3：细胞筛选：该阶段就是根据实验目的，选择合适的筛选压力/药物对细胞进行筛选，获得不同筛选条件的细胞进行后续的数据分析。

阶段4：文库分析：该阶段就是对筛选各组的细胞，提取基因组DNA后，对细胞群体内的sgRNA序列进行特异性PCR和NGS测序，通过对比筛选组别之间的sgRNA种类，丰度变化，从而鉴定出一系列与筛选条件有关的候选基因。

图1. CRISPR/cas文库筛选一般流程

从sgRNA文库筛选流程中可以看出， 文库质粒构建是后续实验的重要基石。要想成功获得可靠的候选基因，编辑效率有效性高，丰度均一，覆盖率高的sgRNA文库质粒绝对是重中之重。所以今天小编就倾囊相授，解密从sgRNA设计到合格的sgRNA文库质粒构建全流程。