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艾美捷科技
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说起RNA甲基化，已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰是N6-腺苷酸甲基化（m6A）。
m6A甲基化检测方法有哪些？
目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS）等。高通量测序偏向单碱基水平鉴定m6A；而比色法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平，Epigentek公司推出的这款名为EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit试剂盒（P-9005），原理与ELISA反应类似，经过优化后检测m6A灵敏度会更高，操作更为简便。
p-9005检测的疑难杂症和药方
- 病症一：样本
对于这个试剂盒，很多人对与样本方面有很多的疑问，虽然试剂说明书上说可适用任何物种的m6A检测，但是同学们还是有各种各样的问题：
（1）RNA样本类型
处方：培养的细胞，新鲜和冷冻的组织，石蜡包埋的组织，血液，体验等等样本的总RNA，mRNA，tRNA，rRNA和snRNA均可适用该试剂盒。
（2）RNA样本提取方式
处方：市面上销售的试剂盒提取的均可，Trizol法可能是可以的，但是Trizol法提取的请确保提取后将RNA重新溶解在不含RNase的水中或合适的缓冲液（例如TE）中，并且RNA质量高且相对不含DNA。
（3）RNA样本符合要求的标准
处方：OD 260/280 >1.9。260/230 > 1.7 【无DNA污染】
- 病症二: 对照
关于试剂盒中的对照方面，也是有很多同学问询。
（1）阳性对照怎么设置
对于第一次上手做这个实验的同学们或许都会有些疑惑，阳性对照难道不都是要做标准曲线的吗？不然怎么对照和计算呢？
处方：其实，这个试剂盒是可以根据实验需要进行选择做单点对照（0.5ng/ml）还是做标准曲线（0.02~1ng/ml）。建议做复孔哟。
（2）阳性对照信号太弱
处方：【1】添加至孔中的PC量不足，确保加入足够量的PC；【2】标准液未进行最佳稀释，并充分混合；【3】确保PC的保存方式是按照说明书进行保存的，一定要保存在指定条件下哟，【4】在使用的时候，要注意稀释后放置在冰上，保证有效成分不被讲解。
（3）阴性对照背景值太高
处方：【1】可能没有洗干净，按照说明书进行清洗；【2】被PC或者样本污染了，切记要换枪头加样；【3】孵育时间太长，按照说明书进行操作1~10min，最长也不能超过2h；【4】显色时间过长，可适当缩减显色时间。
（4）样本值太低或者没信号
处方：
【1】可能是因为没有加入足够量的RNA。厂家推荐的样本输入量为100ng~300ng，200ng为最佳，但是这又不是绝对的噢，同学们可根据自己的样本做相应的调整尤其在信号偏弱的情况下，可适当上调RNA的输入量。
【2】可能是因为产品本身m6A的含量就很低。
【3】可能是样本的纯度不够，有DNA或者其他的污染，或者RNA发生了降解，这些都可能造成低信号。
【4】mRNA样本的话，可能因为片段太小（<80 nts）,也会导致低信号。
3.病症三：数据分析
（1）如何计算标曲
处方：线性回归，二阶多项式，四参数对数回归都可以。
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（2）不同输入量检测出来的数据是否可一同进行数据分析?
处方：是可以的，但是要注意计算的时候要以不同的数据进行。比如你第一次的样本输入量是200ng，计算公式带入的值为200；第二次样本输入量是300ng，计算公式带入的值必须为300.
（3）什么情况下的样本OD值被认为是可用的？
处方：只要样品的OD高于NC的数值，该数据仍可用于计算m6A水平。
（4）重复孔之间差异较大怎么计算？
处方：对于重复孔之间差异较大，我们若是重复孔3个以上的话，我们一般会选择舍弃其中差异特别特别大的一个值后再进行计算，但是只有2个孔的话，该怎么办呢？这个时候我们不能随便舍弃任何一个孔的值，同样也没有办法提供相关的建议。但是需要注意：p-9005比色测定的%CV约为15%。
4.病症四：稀释
（1）需要稀释的试剂组分如何稀释？
处方：按照说明书上给的配制比例进行稀释，用TE buffer稀释，建议即用即配，计算好所需的量再进行稀释配制。
（2）为什么有些组分稀释后需要放置在冰上？
处方：使用前应将稀释的成分（例如PC标准品）放在冰上，以减少试剂降解并保持试剂完整性。
（3）稀释液必须是TE吗？可以替换成DEPC水或者无RNAase的水吗？
处方：可以使用DEPC水替代TE buffer，无RNAase的水也可以。
5.其他
（1）所有组分需要放置在室温条件下回温吗？
处方：对于产品组份中的Wash buffer，保存在低温下可能会有盐离子等沉淀，在使用前需要将其拿至室温进行回温，沉淀即可溶解，这样可进行正常的实验。
（2）如何减少复孔间差异？
处方：
【1】在板中垂直而不是水平地加载复制样品，因为这可以确保同时添加溶液以复制孔，并有助于最小化复制差异。
【2】确保从孔中完全去除洗涤缓冲液，因为任何残留的缓冲液都会增加背景信号和重复变异性，尤其是在敏感的ELISA中（例如用于甲基化检测的ELISA）。
【3】使用手动移液器代替典型的板轻拂/倾倒方法，以确保完全去除缓冲液并减少孔间污染。
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