PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 ...

  PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量。模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败。而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量。 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如S ...

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的。 (一)酶活性与热稳定性 该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散， ...

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备 ...