hESC细胞培养教程第四节：hESC细胞传代

hESC细胞培养教程第四节：hESC细胞传代

1. 从培养箱中取出待传代细胞，吸弃孔内的hESC培养基，加入2 mL/孔的DPBS，轻轻摇晃并吸弃，再加入2 mL/孔的Immocell EDTA传代工作液(0.5 mM),使溶液完全覆盖孔底，将培养板置于细胞培养箱中;

注意：保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触了，使其受热均匀，不要叠放，设定消化时间10 min;

2. 吸弃6孔板中1孔的Matrigel包被液，加入预温的 Y-27632+hESC完全培养基2 mL/孔

在6孔板上做好标记(细胞名称，代次，传代比例，日期和操作人);

3. 消化结束后，从培养箱中取出消化的细胞，显微镜下观察细胞的变化，大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;

4. 将消化好的细胞培养板拿回生物安全柜中，避免震荡摇晃细胞，倾斜吸弃Immocell EDTA传代工作液，加入2 mL/孔预温的Y-27632+hESC完全培养基，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质;

5.可轻柔吹打细胞1-2次;不能超过2次，避免将细胞吹打成单细胞状态，注意避免刮擦细胞，有部分细胞(10-15%)未脱离基质是正常，若有大量未脱离则需延长消化时间;

6.一次操作不要超过1个6孔板，当hESC培养基加入后要快速吸出。因为EDTA传代工作效果在hESC培养基加入后会很快被终止，在hESC培养基加入后细胞又会很快贴壁，而hESC培养基不能长时间处于EDTA传代工作液(<15min),所以收集接种细胞时操作必须快速。