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讲师介绍
云克隆市场部
十年经验，值得信赖。
视频介绍
- 原型物种：人
- 来源：缺血再灌注肝损伤
- 模式动物品系：SPF级Balb/c小鼠，雄性，周龄为6w~8w，体重为20g-25g。
- 实验分组：实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。
- 实验周期：4-6 weeks
- 建模方法：
- 1 小鼠术前12 h禁食，自由饮水。
2 腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75％乙醇术区消毒。
3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏供血的门静脉和肝动脉。
4 用无创血管夹夹闭门静脉和肝动脉，0.5min后，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放在37℃恒温加热垫上保温。
5 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，0.5min左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。待小鼠清醒后放回饲养室饲养，密切关注小鼠的状态及生存状况并做好记录。
4.注意事项：
1 分离肝门时用棉签分离，可避免对肝脏的损伤
2术前禁食有利于手术进行
3阻断血流要一次成功，否则会造成缺血预处理，减轻损伤程度
4取材时镊子不要损伤肝脏 - 应用：用于研究肝部损伤模型
- 模型评价
肝脏缺血损伤评分：
0分：无肝细胞损伤
1分：轻度损伤，特点为细胞质空泡化，病灶核固缩
2分：中度损伤，血窦膨胀，细胞溶质空泡化，细胞边界模糊
3分：中度到重度损伤，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊红细胞增多，中性白细胞着边（附着于血管壁）
4分：严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入
组织病理学
组织病理学
取肝左叶组织1.5cm×1cm×0.2cm于溶液中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后行HE染色，tunel染色。作坏死评分。肝小叶结构严重破坏，网状纤维支架塌陷，肝细胞坏死，空泡变样，肝细胞索、肝窦充血肿胀，边界不清，周围有炎性细胞浸润。
标志因子水平
生化指标检测：分别检测术后0h、3h、6h、12h、24h及72h小鼠鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平，γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，总胆红素(T-Bil)，直接胆红素(D-Bil)，间接胆红素(I-Bil)，总胆汁酸(TBA) 。
流式检测：
1. 样本前处理
①剪碎：将消化液中的组织充分剪碎
②加入消化液：每个肝组织加入5ml消化液
③消化：37℃消化 45min
④ 中止：消化完的组织加入终浓度为10%FBS的1640 10ml，终止酶反应。
⑤过滤：将组织悬液经200目滤网过滤
⑥洗涤：收集单细胞悬液至于50ml EP管中，2000rpm 离心10min。
⑦叠层：用小鼠淋巴细胞分离液叠层处理
⑧ 收细胞：吸取位于中间的透明细胞层，FACs buffer 离心洗涤细胞一次。
2. 流式染色：
①FcR封闭：加入1% FcR 阻断剂（anti CD16/32 antibody），每样本100ul。4℃ 孵育30min，FACs buffer 离心洗涤。
②样本表面抗体工作液：
配置混合抗体工作液，每样本100ul；
加入抗体工作液后，4℃ 孵育避光30min，FACs buffer 离心洗涤。
PerCP anti-mouse CD11b
PE/Cy7 anti-mouse Ly-6G
FITC anti-mouse CD45
PE anti-mouse F4/80
3.样本胞内染色：
加入固定破膜液50ul，用枪头轻柔吹打重悬，室温避光45min。完成后，加入1x perm/wash buffer洗涤。
4.染色完成，重悬细胞：
样本染色完成（每样本使用200ul FACs buffer重悬），4℃ 避光保存，待上机。
5.流式上机：
上机样本，收集总数目50万/细胞。
统计学分析
应用SPSS软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x ±ｓ）表示，采用ｔ检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示有显著差异。
