细胞低血清培养应用
5.1 MD611培养基低血清转瓶生产口蹄疫疫苗
某生产企业，使用15L转瓶进行BHK21细胞低血清培养，血清含量为3-4%，细胞培养好后进行口蹄疫病毒的接种，收获病毒后检测病毒毒力，同时用含10％血清的正常培养基培养的细胞为病毒培养对照，试验结果表明低血清培养组和对照组培养的病毒毒力没用明显差异，结果见下表。
口蹄疫毒力检测结果 | ||||||
实验组 | ||||||
接毒批号 | 瓶数 | 收毒时间（H) | LD50 | TCID50 | ||
S001P | 15 | 15 | 7.00 | 7.33 | 5.75 | 6.00 |
S002P | 15 | 15 | 7.00 | 7.00 | 5.50 | 5.50 |
S003P | 15 | 12 | 6.50 | 6.50 | 5.50 | 5.50 |
S004P | 12 | 15 | 7.33 | 7.00 | 5.25 | 5.50 |
S005P | 11 | 13 | 7.33 | 6.67 | 5.50 | 5.50 |
S006P | 10 | 14 | 6.33 | 6.50 | 5.25 | 6.00 |
S007P | 18 | 12 | 6.67 | 6.50 | 6.00 | 5.75 |
S008P | 11 | 12 | 7.33 | 7.33 | 5.75 | 5.75 |
S009P | 15 | 14 | 6.67 | 6.67 | 5.75 | 5.50 |
S010P | 16 | 15 | 8.00 | 7.33 | 5.50 | 5.50 |
S011P | 16 | 14 | 7.33 | 7.50 | 6.00 | 5.50 |
S012P | 7 | 14 | 7.00 | 6.67 | 6.00 | 5.75 |
S013P | 16 | 13 | 6.67 | 6.67 | 6.00 | 5.75 |
S014P | 21 | 13 | 7.00 | 7.33 | 6.00 | 6.25 |
S015P | 22 | 14 | 7.00 | 6.67 | 5.75 | 5.75 |
平均 | 13.7 | 7.01 | 6.91 | 5.70 | 5.70 | |
总计 | 220 | |||||
对照组 | ||||||
接毒批号 | 瓶数 | 收毒时间 | LD50 | TCID50 | ||
S001P | 4 | 18 | 7.50 | 6.00 | ||
S002P | 4 | 18 | 6.67 | 5.25 | ||
S003P | 4 | 14 | 7.00 | 5.25 | ||
S004P | 4 | 16 | 7.50 | 5.25 | ||
S005P | 4 | 14 | 7.00 | 5.25 | ||
S006P | 5 | 16 | 7.00 | 5.50 | ||
S007P | 2 | 12 | 6.67 | 5.50 | ||
S008P | 4 | 12 | 6.67 | 5.50 | ||
S009P | 4 | 15 | 7.33 | 5.25 | ||
S010P | 5 | 16 | 7.67 | 5.25 | ||
S011P | 4 | 15 | 6.67 | 5.75 | ||
S012P | 4 | 16 | 6.67 | 6.00 | ||
S013P | 5 | 14 | 6.33 | 5.50 | ||
S014P | 8 | 19 | 8.33 | 5.75 | ||
S015P | 8 | 15 | 7.50 | 6.25 | ||
平均 | 15.3 | 7.10 | 5.55 | |||
总计 | 69 | |||||
中农威特生物科技股份有限公司刘学荣等，对不同血清浓度的低血清培养基培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的试验进行了研究。使用MD611培养基对112代BHK21细胞，进行低血清驯化适应，之后继续用低血清培养基连续传代30代以上，将该细胞按为1：5分种比例进行细胞传代，以传统培养基加10%小牛血清培养的细胞为对照组。试验组的血清含量分别为5%、4%、3%、2%和1%。其中血清含量为5%的记为Ⅰ组，血清含量为4%的记为Ⅱ组，以此类推，共计五组。接种口蹄疫病毒ONXC/92株细胞毒（猪牛羊口蹄疫O型灭活疫苗制苗毒株）进行病毒繁殖，并检测病毒液效价。试验结果见下表。各种血清浓度的低血清培养基培养的BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的效价
组别 | 第一试验 | 第二试验 | 第三试验 | 平均值 | ||||
TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | |
对照组 | 7.5 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.5 | 7.5 | 7.54 | 7.72 |
Ⅰ | 8.11 | 8.5 | 7.83 | 8.33 | 8.0 | 8.17 | 7.98 | 8.33 |
Ⅱ | 7.83 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.5 | 8.33 | 7.65 | 8.0 |
Ⅲ | 8.0 | 8.33 | 7.83 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.83 | 8.0 |
Ⅳ | 7.61 | 8.5 | 8.17 | 8.0 | 7.83 | 7.67 | 7.87 | 8.0 |
Ⅴ | 7.61 | 8.33 | 8.37 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.86 | 8.0 |
试验结果表明，低血清培养的BHK21细胞的各组病毒效价均达到疫苗规程规定的不小于7.50的标准，比对照组略高，该细胞经低血清适应后，仍对口蹄疫病毒敏感。
5.2 MD611培养基低血清生产猪伪狂犬疫苗
某企业利用猪伪狂犬病毒弱毒株Bartha-K61进行细胞培养，培养基种类为普通细胞培养基（BD-199）和清大天一低血清培养基MD611。观察不同细胞培养基维持鸡胚成纤维细胞单层（CEF）生长情况，并测定病毒产量（TCID50/ml）。结果在生产条件下，应用低血清培养基MD611添加0.5～2%新生犊牛血清，制备的维持液培养细胞单层生长良好，细胞间隙不明显，细胞形态正常。细胞单层接种病毒培养18-24小时左右，有少量细胞形成CPE，继续培养至48小时左右，70%以上细胞产生CPE，此时病毒增殖达到高峰，测定病毒产量达到2×10-6.75～2×10-7.5TCID50/ ml，符合猪伪狂犬病活疫苗制苗要求，实际应用低血清培养基制备的活疫苗可有效防制疫苗注射引起的过敏反应。
不同培养基培养CEF细胞生长情况和病毒特异性CPE形成情况比较
组别 | 维持液种类 | 血清 含量（%） | 细胞单层生长状态 | 病毒特异性CPE形成（18小时） | |
试验组 | Ⅰ | MD611 | 2% | 细胞单层生长状态优良，无可见细胞间隙，细胞形态良好 | 少量细胞形成CPE |
Ⅱ | MD611 | 0.5% | 细胞单层生长良好，细胞间隙不明显，细胞形态正常 | 少量细胞形成CPE | |
对照组 | Ⅰ | BD-199 | 2% | 细胞单层生长良好，细胞之间间隙很少，形态正常 | 少量细胞形成CPE |
Ⅱ | BD-199 | 1% | 细胞单层生长状态变差，形态瘦长，细胞间隙增大 | 少量细胞形成CPE | |
不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中不同批次细胞毒液的TCID50/ ml比较
批次 | 维持液种类 | 维持液血清含量 | TCID50/ ml |
060713 | BD-199 | 2% | 2×10-7.0 |
MD611 | 2% | 2×10-7.25 | |
060728 | BD-199 | 2% | 2×10-7.25 |
MD611 | 2% | 2×10-7.5 | |
060811 | BD-199 | 2% | 2×10-7.25 |
MD611 | 2% | 2×10-7.25 | |
060818 | BD-199 | 2% | 2×10-7.0 |
MD611 | 2% | 2×10-7.25 | |
070503 | BD-199 | 1% | 2×10-6.5 |
MD611 | 0.5% | 2×10-7.0 | |
070510 | BD-199 | 1% | 2×10-6.75 |
MD611 | 0.5% | 2×10-7.25 | |
070523 | BD-199 | 1% | 2×10-6.25 |
MD611 | 0.5% | 2×10-6.75 | |
070530 | BD-199 | 1% | 2×10-6.5 |
5.3 MD504低血清转瓶生产狂犬病疫苗
某企业在3L转瓶中，使用MD504培养基与199培养基培养Vero细胞并接种狂犬病毒进行病毒培养，199培养基使用单层的3L转瓶，MD504培养基使用双层和三层3L转瓶，细胞培养阶段使用血清含量均为3%，使用MD504培养基在多层瓶中培养狂犬病毒，病毒滴度高于基础199培养基单层瓶培养，收毒次数增加2次。
MD 504与199培养基三种培养瓶细胞培养狂犬病毒滴度比较
培养瓶类型 | 单层瓶（3L） | 双层瓶（3L） | 三层瓶（3L） | ||
细胞培养基 | 199 | MD504 | MD504 | ||
滴度 | A组 | 一次苗 | 6.86 | 6.25 | 5.9 |
二次苗 | 6.9 | 7.1 | 7.19 | ||
三次苗 | - | 6.9 | 7.5 | ||
四次苗 | - | 7.0 | 7.5 | ||
B组 | 一次苗 | 6.5 | 6.0 | 6.5 | |
二次苗 | 6.83 | 6.83 | 7.73 | ||
三次苗 | - | 7.0 | 7.5 | ||
四次苗 | - | 7.5 | 7.83 | ||
5.4 MD504低血清培养地鼠肾细胞
某企业在相同条件下解剖、消化、培养的原代细胞分为两组，按相同传代比传次代，一组用低血清培养基添加3％血清进行传代、维持病毒培养，另一组用传统培养基添加6％血清。使用MD504培养基生产相同批量的产品，血清投入量节省50％以上，地鼠用量节省30％。
地鼠肾细胞在低血清培养基与传统培养基培养结果比较
低血清培养基 | 传统培养基 | |
新生牛血清量 | 3％ | 6％ |
维持时间 | 长 | 短 |
收毒次数 | 6次 | 3次 |
病毒毒力 | 6.8 | 6.4 |
默克密理博北京清大天一细胞培养基的研发、制造适应了疫苗、抗体药物行业的技术发展需要和生产需要，细胞培养基产品和业务包括无血清培养基、低血清培养基、反应器悬浮培养基等个性化细胞培养基，基础细胞培养基，以及客户定制细胞培养基服务。