细胞低血清培养技术

4.1转瓶细胞低血清培养方法
4.1.1 应选择细胞培养液pH应不低于6.8的，细胞瓶中细胞应形态良好、分布均匀的致密单层细胞瓶细胞进行细胞传代。
4.1.2 将细胞生长良好的培养瓶，轻微摇瓶后倒去细胞培养液，加入含0.25％胰酶和0.025％EDTA的消化液消化细胞，转动细胞瓶使细胞消化液浸润细胞1～3分种，倒去细胞消化液，静止细胞瓶待细胞滑落，加入细胞培养液，摇瓶分散细胞。建议使用Hanks’液或PBS溶液配制，pH为7.6～7.8。细胞消化配制后应及时使用。
4.1.3 使用含3％-5%血清的低血清细胞培养基，BHK21细胞按1:8～1:12分种比例分种细胞，Vero细胞按1:3～1:4分种比例分种细胞，15L转瓶细胞培养液加量为2～2.5L/瓶。细胞分种时应控制分种比例，细胞培养1天时细胞汇合率为40％～80％为宜。
4.2.4 用15L转瓶培养BHK21细胞和Vero细胞，培养温度为37±0.5℃，转数为10～12rpm。
4.2.5 BHK21细胞培养时间约为48小时，Vero细胞培养时间约为72小时，细胞应生长为致密单层，pH应大于6.8～7.0，当细胞生长为致密单层后应及时传代。

4.2 转瓶细胞低血清培养注意事项
4.2.1 细胞培养使用血清浓度为2％～5％，由于国内血清质量差异，建议使用前进行细胞培养筛选，并建议实际使用血清浓度不低于3% 。
4.2.2 BHK21细胞和Vero细胞可直接用4～5％血清浓度培养基进行转瓶细胞培养，培养初期可能细胞培养状态略差，适应几代后能良好生长。 如用方瓶进行4～5％血清浓度培养基进行几代适应培养后再进行转瓶培养，细胞培养效果更好。 如依次用10%血清浓度、8%血清浓度、5%血清浓度、3%血清浓度传代适应细胞，细胞培养效果更好。
4.4.3 如用4～5％血清浓度培养基进行BHK21细胞和Vero细胞适应培养后，冻存适应的细胞建立低血清细胞种子库，用该库细胞复苏进行低血清培养，细胞培养效果更佳。
4.4.4 用于培养的细胞培养液应按产品说明书标示量加入碳酸氢钠，配液后pH为7.2～7.4；培养液如常时间搅拌或长期存放，pH可能增加；用于培养细胞的培养液，pH为7.4～7.6，一般情况下不影响细胞培养效果。不可随意减少或增加碳酸氢钠的使用量，否则影响培养液的缓冲能力和渗透压。
4.4.5 用于细胞消化的细胞消化液，应现配现用，或冻存使用，应注意消化液细胞消化效果，应在2～3分种内完成细胞消化。 应控制细胞消化的时间和细胞消化液的加量，倒去细胞消化液时，细胞应附着良好，放置1～2分种后，细胞能自然滑落，应避免细胞成片垮掉。
4.4.6 初次用于低血清传代的种细胞质量，对于传代成功性极为重要；应选择良好的细胞用于低血清适应培养，应当在细胞刚生长为致密单层时即传代，传代时细胞培养液pH应保持6.8～7.0左右，传代2～3代后，作为种细胞用于低血清细胞培养。
4.4.7 控制细胞传代分种比例是成功培养的关键之一。对于BHK21细胞，初次用于低血清传代的种细胞，分种比例建议用1:4～1:6，待细胞完全汇合后略微生长为致密单层即传代，之后可适当增加传代分种比例至1:6～1:9。控制细胞传代生长的pH是成功培养的关键之一。细胞培养液pH降低到6.8～7.0，应及时传代。 控制细胞传代生长状态是成功培养的关键之一。细胞培养第1天细胞汇合率应为40％～80％，培养第2天应为单层细胞，细胞生长为致密单层应及时传代，不可延长细胞培养时间。 控制细胞传代生长时间是成功培养的关键之一，通常培养2天应及时传代。
4.4.8 按以上程序和注意事项进行BHK21细胞和Vero细胞低血清培养，如细胞不能正常贴壁培养，应考虑细胞瓶质量，建议用新的细胞培养瓶按正常程序处理后进行细胞培养；或考虑细胞质量，更换低代次或不同来源细胞进行细胞培养。
4.4.9 转瓶低血清培养BHK21细胞和Vero细胞，细胞培养液中通常可见油膜状物或白膜状物出现，以及较多悬浮细胞，均为正常的细胞悬浮培养物，不影响细胞培养生长。
4.4.10 BHK21细胞和Vero细胞低血清培养，通常生长为单层细胞，该细胞具有更好的细胞活力，与传统的复层细胞比较，能更好的支持病毒培养，不影响病毒滴度。由于细胞使用低血清条件进行培养，病毒病毒接种培养后可能导致病毒收获时间的差异，建议接种病毒后每2～3小时取样，检测病毒滴度，确定病毒收获时间。

4.3 BHK21细胞转瓶低血清培养效果
我们使用3％小牛血清，用3L转瓶进行BHK21细胞的低血清培养，传至29代，细胞培养良好，分种传代比例达到6－10。通常24小时培养细胞可达到60％－80％的汇合比例，培养48小时细胞生长为致密单层。

BHK21细胞3L转瓶培养24小时照片                             BHK21细胞3L转瓶培养48小时照片

我们使用3％小牛血清，用15L转瓶进行BHK21细胞的低血清培养重复实验，细胞传至30代以上，细胞培养良好，分种传代比例达到8－12。通常24小时培养细胞可达到60％－80％的汇合比例，培养48小时细胞生长为致密单层，但培养72小时细胞局部脱落。

  
BHK21细胞15L转瓶培养24小时照片                   BHK21细胞15L转瓶培养48小时照片

  
BHK21细胞15L转瓶培养72小时照片

某生产企业，使用15L转瓶进行BHK21细胞低血清培养，血清含量为3-4%，细胞培养48小时按1:8分种比例进行细胞传代，同时用含10％血清的正常培养基最为细胞培养对照，试验共进行了15代次的细胞培养，细胞培养效果达到10％血清培养水平，结果见下表。

4.4 Vero细胞转瓶低血清培养效果
在3层3L转瓶中，使用MD504培养基与进口199培养基进行Vero细胞的培养比较试验，MD504培养基使用血清含量为3%，199培养基使用血清含量为10%，细胞培养4天时，使用MD504培养基的转瓶细胞数量比进口199培养基的对照组平均每瓶多3×108个细胞，细胞数量提高43.5％。

MD 504与进口199培养基三层瓶中细胞数量比较

编辑： tong202    来源：默克密理博北京清大天一