细胞低血清培养基
2.1培养基组成
细胞培养基是指人工模拟细胞在体内生长的营养环境、维持细胞生长的营养物质，它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养基的选择和配制是体外培养技术的一个关键问题。在细胞培养中，常用的基础细胞培养基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等，人工合成基础培养基使用时需添加一定量的血清使细胞生长和繁殖。
细胞培养基的主要成分包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。氨基酸是组成细胞蛋白质的基本单位。不同的细胞对氨基酸的需求各异，但几种必需氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，即必须氨基酸，如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余为非必需氨基酸，细胞可以自己合成，或通过转氨作用由其他物质转化而来。在BHK21细胞低血清培养时，为增加培养基的营养成分，除了增加必须氨基酸的含量外，还应增加非必须氨基酸的种类，并应根据BHK21培养和代谢的特点，均衡各种氨基酸的比例，有效降低代谢有害物的积累，从而提高BHK21细胞低血清培养的效果。在细胞培养基中，谷氨酰胺对BHK21细胞低血清培养至关重要。谷氨酰胺是作为能源及碳源物质同时被细胞利用，也是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡，同时谷氨酰胺还能促进细胞的良好贴壁性，在缺乏谷氨酰胺时，经消化处理的细胞无法正常贴壁生长。因此，谷氨酰胺可提高BHK21细胞低血清培养的效果。同时应注意到，而外多余的谷氨酰胺对细胞培养的危害性，高含量的谷氨酰胺会导致氨的积累，影响细胞正常生长。谷氨酰胺是一种最不稳定的氨基酸，在培养基中降解形成吡咯烷酮羧酸和氨。在细胞培养温度下，谷氨酰胺分解的半衰期为一周左右，因此配制的细胞培养液应低温保存，一般在2－3周内使用。不同温度和pH条件谷氨酰胺的降解见下图：
pH为7.6时不同温度2mM谷氨酰胺的稳定性
室温下不同pH时10mM谷氨酰胺的稳定性
维生素是维持细胞生长的一种生物活性物质，对细胞代谢有重大作用。它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。维生素分为水溶和脂溶两大类，水溶性维生素有B族维生素、胆碱、叶酸、肌醇等，脂溶性维生素有维生素A、D、E、K等。葡萄糖是细胞生长维持的碳源和能量来源，葡萄糖缺乏会导致细胞的死亡。对于MD611和MD504低血清培养基，不能配制为浓缩液使用，也不能冻存保存。在培养基的成分中，氨基酸有碱性的和酸性的，而对于维生素而言既有水溶性的也有脂溶性的，由于低血清培养基提高了各种营养成分的含量，将低血清培养基配制为浓缩液，或冻存后重新融化，会导致氨基酸、维生素等成分发生不可逆的沉淀，致使培养液出现混杂，影响细胞培养效果。
培养基中无机盐可以维持培养基渗透压平衡，并参与细胞的代谢活动，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K+对于激活某些酶是必需的，并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。Mg2+是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。
2. 2 细胞培养基发展史
细胞培养基是伴随在细胞培养技术发展起来的。
1950年，Morgan等设计了199细胞培养基，含有53种成分，用于多种细胞培养。1955年，Eagle在大量试验研究的基础上设计开发了基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），含有12种氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。Eagle培养基配方简单，适于各种传代细胞系和特殊研究，在此基础上产生了多种改良的细胞培养基，如MEM、DMEM、IMDM等。1959年，在基础Eagle培养基基础上，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，产生了低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），适合多种细胞单层生长，是一种被广泛应用的培养基。DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）两种，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养，例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。1967年， Moore等人针对淋巴细胞培养设计研制了RPMI1640培养基，含21种氨基酸和11种维生素，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。20世纪60年代，利伯曼和奥维等首先进行了无血清培养的尝试，经山根、佐藤春太郎等发展，目前无血清培养基（又称无血清限定培养基或简称限定培养基）已在全世界广泛应用和发展。这类培养基主要以各种激素（如胰岛素、各种前列腺素、生长激素等）、生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、MSA等）、 维生素、载体蛋白如转铁蛋白(铜蓝蛋白等)、微量元素（镉、硒等）、乙醇胺以及贴壁与展开因子（如昆布氨酸、纤维网素等）取代含血清培养基中的血清部分，不但排除了血清的干扰，而且，还可以在更接近体内的条件下维持细胞的功能和活力。
从细胞培养基的发展史，我们不难发现，广泛使用的普通培养基大多在20世纪50年代和60年代就已经发展成熟，已经具有50多年的使用历史。随着生物制药行业的竞争日益激烈，能否及时迅速的占领市场，同时降低生产成本，提高生产效率，确保生物制品安全就显得尤为重要，而作为生物制药主要原材料之一的细胞培养基，是否能最大程度的满足生产的需要就成为生物制药企业所面临的主要问题。因此只有根据自身的生产工艺使用符合自身要求的培养基，才能在瞬息万变的市场中立于不败之地。不同的生物制品，不同的细胞株，不同的生产工艺，都需要与之对应的细胞培养基来支持。目前，国际生物制药企业在进行大规模细胞培养时，往往采用的并不是上述的传统细胞培养基，世界著名的生物制药公司如Amgen、Genetech，与培养基企业合作，研制适合自身细胞特点的个性化细胞培养基，个性化培养基是国际生物制药公司应用培养基的普遍模式。我国生物制药企业定制培养基也在逐渐发展，MD611培养基和MD504培养基，就是针对BHK21细胞和Vero细胞设计的个性化低血清培养基。由于个性化培养基是针对不同细胞培养特点设计的培养基，因此在细胞培养方面具有优势。个性化培养基可为细胞生长提供充足的营养物质，能提高细胞的生长速率、培养密度、以及延长细胞维持时间；也可为细胞生长提供均衡的营养供给，能减少细胞有害代谢物质的积累，降低对细胞生长的危害；同时有利于病毒或蛋白药物表达率的提高；也能减少或不使用动物源成分，安全性更有保障。
2.3 细胞培养基选择
根据培细胞或病毒特性、培养方式选择培养基，不同的细胞株和培养条件都有着不同的营养需求，这就需要配一个最优化的细胞培养基，才能够提高细胞培养的效果，增加生物制品的产率。
选择高品质的细胞培养基，虽然大多数普通培养基均为公开配方，但不同厂家生产出来的产品质量存在差异，做为生物制药的重要原料，应选择按照药品GMP要求对人员、设施与设备、生产过程、质量控制等方面管理的培养基制造商，才能保证培养基的品质。
从经济性角度选择细胞培养基，降低生产成本，始终是企业增加效益的追求的目标，特别是在具有产品竞争压力之下，从降低生产成本方面来选择培养基，不仅仅在于选择低价格成本的细胞培养基，而是在于使用合适的培养基来降低整个生产系统的综合成本。在细胞培养过程中，由于血清的使用量大，单价较高，其所占的生产成本占原材料的一半以上，通常是细胞培养基的3－10倍，因此选择合适的培养基来降低血清使用量，是减低生产成本的有效方法和途径。
2.4 MD611和MD504低血清细胞培养基
营养丰富的培养基是维持细胞活性及高密度生长的基础，营养缺乏容易引起细胞凋亡，新生牛血清中所含大部分营养成分可以通过化学成分明确的营养物质如氨基酸维生素等成分组合取代，因此，开发细胞低血清培养基成为可能。低血清培养基营养成分优于基础培养基，仅需添加1％～5％新生牛血清，而对细胞生长、增殖、形态、活性和功能没有影响甚至有所改善。在国外低血清培养基早已有之，但是很多他们的低血清培养基是在基础培养基中选择性的加入重组胰岛素（recombinant insulin）、人源转铁蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些还包含一些生长因子，这些重组蛋白和动物来源成分对生物制品的安全性有很大影响。
北京清大天一生物技术有限公司开发了MD611和MD504低血清培养基, 已经成功用于人用狂犬病疫苗生产和口蹄疫疫苗生产。MD611为BHK21细胞培养设计开发的个性化低血清培养基，可支持BHK21低血清生长，同时也可用于Vero细胞的低血清培养。MD504培养基为Vero细胞培养设计开发的个性化低血清培养基，可支持Vero细胞的低血清培养。
与传统的MEM培养基和199培养基比较，MD611培养基和MD504培养基，在细胞培养效果、降低生产成本、以及提高产品品质方面具有明显优势。MD611和MD504培养基不含任何血清替代物、动物来源蛋白、以及酵母水解物，具有良好的使用安全性；使用低血清培养基进行细胞低血清培养，可降低培养细胞的血清使用量，有益于减少血清成分以及血清中潜在外源病毒对产品质量的危害，可提高产品质量，并能提高细胞传代分种比例，提高病毒产率，可降低产品生产成本。
2.5 MD611和MD504低血清培养基配制方法
MD611和MD504培养基不同于传统的培养基，培养基的正确配制和使用方法影响细胞的培养效果，应严格按使用说明书配制使用。以50L/包规格低血清培养基为例，应按以下程序配制培养基。
2.5.1 打开培养基包装，将培养基全部倒入一容器中。
2.5.2 用少量冷却注射用水（20℃～30℃）涮洗袋内残留培养基，倒入容器内。
2.5.3 向容器中加入约40L冷却注射用水（20℃～30℃），搅拌至培养基完全溶解。
2.5.4 按使用说明书标示量加入114.5克碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，补加冷却注射用水（20℃～30℃）至50L，充分混合，用pH计检测，溶液pH应为7.2～7.4。
2.5.5 按使用量加入血清和抗生素，混合均匀，用0.22μm滤膜正压过滤除菌。
2.5.6 除菌后培养基，置2℃～8℃避光保存，应在一周内使用。
2.6 MD611和MD504低血清培养基注意事项
2.6.1 不可配制成浓缩液储存使用。
2.6.2 不可用高压湿热法进行灭菌。
2.6.3 不可冷冻储存，溶解使用。
2.6.4 不可常温储存，2～8℃储存应不超过1周时间。
2.6.5 该培养基中已含谷氨酰胺，由于谷氨酰胺不稳定，易分解，产生对细胞敏感的毒性物质，故加入血清的完全培养液应尽快使用完毕。
2.6.6 按标示量加入碳酸氢钠pH应为7.2～7.4，过滤后pH可升高0.1～0.2；如用开放式大罐长时间搅拌配液，可导致pH升高；如使用容器长时间储存，也可能导致pH升高。应注意不同配液方式对培养液pH的影响。
2.6.7 该培养基中所含指示剂酚红的量是常规量的一半，故从外观上看所配溶液颜色较浅，精确判定pH时，建议用pH计测定pH。
2.6.8 按标示量加入碳酸氢钠，如达不到所需pH要求，应用1N 氢氧化钠调节到所要求pH范围。如用碳酸氢钠调pH至7.6以上，应注意培养液渗透压的增加，可能影响细胞正常培养。
默克密理博北京清大天一细胞培养基的研发、制造适应了疫苗、抗体药物行业的技术发展需要和生产需要，细胞培养基产品和业务包括无血清培养基、低血清培养基、反应器悬浮培养基等个性化细胞培养基，基础细胞培养基，以及客户定制细胞培养基服务。