不同血清浓度的低血清培养基培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的试验研究
刘学荣，宋玉霞，董文教 ，魏怀菊， 牟会琴，王国燕，王 晶，董金杰，陈苗苗， 蔡 芸， 牟克斌， 黄银君
(中农威特生物科技股份有限公司, 甘肃 兰州 730046)
我国口蹄疫的流行由来已久，疫情复杂，我国在口蹄疫的防治上采用的是捕杀和免疫接种相结合的措施，疫苗接种在口蹄疫预防中仍起到非常重要的作用。我国现行口蹄疫灭活疫苗生产工艺相对落后，生产病毒的BHK21细胞全部来自转瓶培养，主要采用最基础的合成细胞培养基，甚至天然培养基（如水解乳蛋白）加入10%左右新生牛血清。使用大量的新生牛血清带来的安全、质量和成本等问题已经突显。为此本公司试图采用低血清培养基培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗，该工作现已完成了细胞驯化和细胞培养试验，本试验将在此基础上用不同血清含量的低血清培养基培养BHK21细胞，并繁殖口蹄疫病毒，比较细胞生长情况和病毒效价，以确定适合生产实际的血清浓度。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞：BHK21细胞112代，使用50%MEM+50%乳汉液加10%新生牛血清的传统培养基培养，购自中国兽药监察所，由中农威特生物技术股份有限公司质量管理部保存和提供，中农威特生物科技股份有限公司研发部驯化适应MEM SLM。
1.1.2 病毒 口蹄疫病毒ONXC/92株细胞毒（猪牛羊口蹄疫O型灭活疫苗制苗毒株），由中农威特生物技术股份有限公司质量管理部保存和提供。
1.1.3 培养基：MEM细胞培养基为GIBCO公司产品，MEM SLM低血清细胞培养基为北京清大天一生物技术有限公司产品，水解乳蛋白为HYCLONE公司产品。
新生牛血清为兰州民海生物技术公司产品。
1.1.4 设备
T75方瓶、XDS实验室系列倒置显微镜、细胞培养箱、干烤消毒柜等设备均为国产设备。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代 将已适应低血清培养的BHK21细胞用MEM SLM连续传代30代以上，分种比例为1：5，以传统培养基加10%小牛血清培养的细胞为对照组。试验组的血清含量分别为5%、4%、3%、2%和1%。其中血清含量为5%的记为Ⅰ组，血清含量为4%的记为Ⅱ组，以此类推，共计五组。
在传代过程中任意选择三代观察细胞的生长状况，记录细胞接种密度和生长密度，取平均值。同时繁殖病毒，检测病毒液效价。
1.2.2 病毒效价检测 由中农威特生物科技股份有限公司质量检验室检测收获病毒液的LD50和TCID50。
1.2.3 细胞计数 台盼蓝染色，用血球计数板计数。细胞密度、细胞活性与细胞比生长速率的计算方法为：
活细胞密度=平均每大格活细胞数×104
细胞活性=（活细胞数/细胞总数）×100%
细胞比生长速率=（生长密度-接种密度）/（接种密度*时间）*d－１。
1.4 观察 每天用倒置显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。
2 结果与分析
2.1 各种血清浓度的低血清培养基培养的BHK21细胞生长情况
已适应MEM SLM的BHK21细胞在血清含量大于2%的情况下均能稳定传代，连续传代均在30代以上，能够满足生产实际需要。添加5%、4%和3%血清的试验组细胞均在48h达到最大量，细胞产量、细胞活性与对照组差异不大；添加2%和1%血清的试验组在72h达到最大量，细胞产量略低于对照组。但当细胞数量达到最大值后，试验组的细胞开始老化，大量细胞悬浮于培养液中，致使细胞数量减少较快，细胞活性也逐渐降低。BHK21细胞在24-48h生长较快，平均比生长率在1.74d-1以上，高于对照组。结果见表1、表2和表3。
表1 不同血清浓度培养时细胞的生长情况（×107）
| 组别 | 对照组 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ |
| 细胞接种量 | 0.462 | 0.42 | 0.415 | 0.403 | 0.387 | 0.352 |
| 细胞数量（24h） | 0.83 | 0.85 | 0.764 | 0.752 | 0.68 | 0.62 |
| 细胞数量（48h） | 1.86 | 2.42 | 2.36 | 2.28 | 1.84 | 1.26 |
| 细胞数量（72h） | 2.51 | 1.98 | 2.12 | 2.04 | 2.20 | 1.73 |
| 细胞数量（96h） | 2.21 | 1.85 | 1.87 | 1.92 | 1.86 | 1.65 |
| 连续传代次数 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 10 |
表2 不同血清浓度对细胞比生长率的影响
| 组别 | 对照组 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ |
| 0-24h | 0.80 | 1.02 | 0.84 | 0.87 | 0.76 | 0.76 |
| 24-48h | 1.24 | 1.85 | 2.09 | 2.03 | 1.71 | 1.03 |
| 48-72h | 0.35 | -0.18 | -0.1 | -0.11 | 0.20 | 0.37 |
| 72-96h | -0.12 | -0.07 | -0.12 | -0.06 | -0.15 | -0.05 |
表3不同血清浓度对细胞活性的影响
| 组别 | 对照组 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ |
| 24h | 95.4% | 96.3% | 94.6% | 97.1% | 95.3% | 94.5% |
| 48h | 96.2% | 96.6% | 95.2% | 95.3% | 97.5% | 96.2% |
| 72h | 93.6% | 90.4% | 93.6% | 94.0% | 94.6% | 95.5% |
| 96h | 88.2% | 87.5% | 90.4% | 89.2% | 86.2% | 89.4% |
试验结果表明，所用的低血清培养基中贴壁因子略显不足，再加上血清含量较少，使细胞进入指数生长期前的延滞期较长，培养初期（0～24h）比生长率较低；但该培养基的扩展因子相对丰富，细胞进入指数生长期后（24～48h），繁殖迅速，平均比生长率在1.74d-1以上，同时这些扩展因子可能也促使细胞老化，即添加5%、4%和3%血清的试验组细胞均在48h后数量减少，添加2%和1%血清的试验组在72h后数量减少。
2.2 各种血清浓度的低血清培养基培养的BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的效价
各种血清浓度的低血清培养基培养的BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的效价检测结果见表4。
表4各种血清浓度的低血清培养基培养的BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的效价
| 组别 | 第一试验 | 第二试验 | 第三试验 | 平均值 | ||||
| TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | TCID50 | LD50 | |
| 对照组 | 7.5 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.5 | 7.5 | 7.54 | 7.72 |
| Ⅰ | 8.11 | 8.5 | 7.83 | 8.33 | 8.0 | 8.17 | 7.98 | 8.33 |
| Ⅱ | 7.83 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.5 | 8.33 | 7.65 | 8.0 |
| Ⅲ | 8.0 | 8.33 | 7.83 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.83 | 8.0 |
| Ⅳ | 7.61 | 8.5 | 8.17 | 8.0 | 7.83 | 7.67 | 7.87 | 8.0 |
| Ⅴ | 7.61 | 8.33 | 8.37 | 8.0 | 7.61 | 7.67 | 7.86 | 8.0 |
试验结果表明，试验各组的病毒效价均达到疫苗规程规定的不小于7.50的标准，比对照组略高，该细胞适应MEM SLM后，仍对口蹄疫病毒敏感。血清浓度对病毒效价影响不大，只要在细胞数量较大、细胞活性较高时接毒，均能得到高效价的病毒液。
3．结论
用低血清培养基进行BHK21细胞大规模培养在国内尚属首次报道，本试验结果表明，低血清培养基MEM SLM营养丰富，能促进BHK21细胞快速生长，同时适应该培养基的BHK21细胞对口蹄疫病毒敏感性较好，繁殖的口蹄疫病毒液效价达到疫苗生产要求，因此，我们认为低血清培养基MEM SLM具有替代传统培养基用于口蹄疫疫苗生产的潜力。
默克密理博北京清大天一细胞培养基的研发、制造适应了疫苗、抗体药物行业的技术发展需要和生产需要，细胞培养基产品和业务包括无血清培养基、低血清培养基、反应器悬浮培养基等个性化细胞培养基，基础细胞培养基，以及客户定制细胞培养基服务。