接种密度对BHK21细胞在MEM-SLM培养液中生长的影响
苏 玲1，2，刘学荣1， 董文教1 ，宋玉霞1， 牟会琴1，王国燕1，王 晶1，董金杰1，陈苗苗1， 牟克斌1， 黄银君1
（中农威特生物科技股份有限公司, 甘肃 兰州 7300462.西北民族大学，甘肃 兰州 730000）
摘要：为探讨不同的接种密度对BHK21细胞在MEM-SLM培养液中生长的影响，本研究选用1∶4 ～ 1∶9 六种不同的分种比例培养BHK21细胞 ，并分别于24h、48h、72h、96h观察和计数，检测细胞的生长密度和细胞活力。结果表明，以不同接种密度接种的BHK21细胞的生长密度不同，其中1∶6和1∶7的接种密度比较适合BHK21细胞在本试验条件下生长。
关键词 BHK21细胞，MEM-SLM培养液，接种密度，比生长速率
叙利亚仓鼠肾细胞(BHK21)或称金黄色仓鼠肾细胞来源方便，繁殖速度快，质量和外源因子易控制，是经WHO 推荐作为生产人用疫苗的细胞基质，适合于多种疫苗的大规模工业化生产。许多研究报道都认为细胞生长的最终密度直接与细胞的接种密度有关。一般认为，细胞接种密度越高，培养结束时所得细胞密度也越高，但细胞增殖倍数逐渐降低。而细胞接种密度较低时，细胞生长至理想的密度需要较长的时间，且培养结束时所得细胞密度较低，但细胞增殖倍数逐渐升高。因此，在细胞大规模工业化生产中，必须选择合适的接种密度，提高细胞的产量，同时尽可能地增加细胞的增殖倍数，提高培养基的利用率。在传统的BHK21细胞培养工艺中大多采用传统的培养基，即MEM 加10%的新生小牛血清，培养过程中细胞的分种比例控制在1∶5和1∶6。本试验拟选用商业化的培养基MEM-SLM，探讨BHK-21细胞在此试验条件下接种密度对细胞生长的影响，以确定适合大规模工业化生产的接种密度。
1．材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞：BHK21细胞112代，使用50%MEM+50%乳汉液加10%新生牛血清的传统培养基培养，购自中国兽药监察所，由中农威特生物技术股份有限公司质量保证部保存和提供，中农威特生物科技股份有限公司研发部驯化适应MEM SLM。
1.1.2 培养基：MEM细胞培养基为GIBCO公司产品，MEM SLM低血清细胞培养基为北京清大天一生物技术有限公司产品，水解乳蛋白为HYCLONE公司产品。
新生牛血清为兰州民海生物技术公司产品。
1.1.4 设备
T75方瓶、XDS实验室系列倒置显微镜、细胞培养箱、干烤消毒柜等设备均为国产设备。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代 将已适应低血清培养的BHK21细胞用MEM SLM按照设计分种比例连续传代5代以上，每隔24小时观察细胞的生长情况，将结果取平均值，其中1∶4记为Ⅰ组，1∶5记为Ⅱ组，1∶6记为Ⅲ组，以此类推直到1∶9，共计6组。
1.2.3 细胞计数
随机抽取每组不同培养时间的细胞各一瓶做细胞计数。细胞计数采用台盼蓝染色液染色3～5min后，用血球计数板点样计数细胞密度，并记录死细胞数。每次计数重复4次，并取平均值。
每毫升原悬乳液的细胞总数=N/4×10000×n，N=四大方格内的细胞总数，n=稀释倍数。
细胞活力=（活细胞数/细胞总数）×100％。
细胞比生长速率=（生长密度-接种密度）/（接种密度*时间）d－１。
1.4 观察
每天用倒置显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。
2．结果与讨论
2.1 不同接种密度时细胞的生长曲线
以不同的接种密度进行细胞培养，细胞生长曲线见图1。试验结果表明提高细胞接种密度可提高最终的细胞密度，这与其它文献报道的结果一致。
图 1 细胞接种密度对细胞生长的影响
细胞接种密度对贴壁培养的细胞而言是重要的生物影响因子，对细胞的贴壁生长及生长参数有非常显著的影响。细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞呈圆球形，接着细胞附着或贴附于培养瓶表面，称贴壁，悬浮期结束。当贴壁以后，细胞就开始分裂增殖，经过一定时期的延滞期后，细胞开始进入指数生长期。这是细胞增殖最旺盛的阶段，可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。之后,随细胞数量不断增多、营养物质的不断消耗、生存空间渐趋减少、代谢产物的不断积累等，细胞相互接触汇合成片，发生接触抑制现象。但只要营养物质还未耗尽，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分进一步减少、代谢产物持续增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。
本试验结果表明，细胞生长至96h后停止增殖，细胞数量开始减少，在镜下观察发现，细胞长到96h后开始老化，形态变得细长，培养液中有大量的漂浮细胞，部分细胞甚至脱落。
2.2 细胞接种密度对细胞活力的影响
表1 细胞接种密度对细胞活力的影响
| 组别 | 0 h | 24 h | 48 h | 72 h | 96 h |
| Ⅰ 1∶4 Ⅱ 1∶5 Ⅲ 1∶6 Ⅳ 1∶7 Ⅴ 1∶8 Ⅵ 1∶9 | 97.0％ 97.0％ 96.7％ 96.6％ 96.2％ 96.1％ | 98.6％ 97.2％ 96.9％ 97.2％ 96.7％ 96.8％ | 97.2％ 98.0％ 96.0％ 97.0％ 95.8％ 96.0％ | 92.5％ 90.4％ 90.9％ 91.7％ 90.9％ 91.4％ | 91.4％ 90.1％ 90.0％ 89.5％ 89.7％ 86.1％ |
随着细胞接种密度的减小，细胞活力趋于减小，而且每一组接种密度的细胞在培养24h后，细胞活力最高。可能的原因是，细胞培养的初期因为营养物质、生存空间等比较充足，溶氧度、PH 环境等比较适合细胞生长，细胞活力比较高。但在48h后，细胞之间为了争夺有限的营养物质、生存空间等，必然导致一部分细胞死亡，细胞活力下降。
2.3 细胞接种密度对细胞比生长速率的影响
在细胞培养中，不同的接种密度可以得到不同的比生长速率，在本试验条件下不同接种密度及不同时间段的细胞比生长速率（μ）见表2。
表 2 细胞接种密度对μ值的影响
| 组别 | 0～24h | 24～48h | 48～72h | 72～96h |
| Ⅰ 1∶4 Ⅱ 1∶5 Ⅲ 1∶6 Ⅳ 1∶7 Ⅴ 1∶8 Ⅵ 1∶9 | 0.957 0.950 1.059 2.310 1.429 2.650 | 2.111 2.462 2.543 2.472 4.176 3.286 | 0.207 0.027 0.298 0.232 0.241 0.389 | —0.107 —0.110 —0.130 —0.429 —0.033 —0.060 |
比生长速率表示在单位体积内单位量细胞经过单位时间增加的细胞量。孙详明，谭文松等曾报道细胞接种密度对延滞期的影响可以用细胞培养过程前24h的平均比生长速率（μ24）来反映，μ24值越大，延滞期越短，μ24值越小，延滞期越长。细胞贴壁速率随着细胞接种密度的增加而提高，高细胞接种密度有利于细胞贴壁，细胞能较快进入生长期，但由于细胞的接种密度过大时，细胞贴壁后扩展受到限制，使得部分细胞不能正常生长；但当细胞接种密度较低时，这种现象不发生或非常轻微，细胞能较快的进入对数生长期；表2中的数据表明，随着细胞接种密度的减小，细胞的平均比生长速率逐渐增加。而且随着细胞的生长，不同时间段的平均比生长速率不同，有一个先升后降的过程。
3．结论
综上所述，在本试验条件下，即在MEM-SLM培养液中培养BHK21细胞，分种密度为1∶6和1∶7时，细胞在48h时活力最高，细胞数量达2.48×107～ 2.50×107，平均比生长率达2.508，增殖倍数在8.235～12.138之间，细胞增殖倍数较大，培养基利用率较高，同时细胞产量较大，适合大规模工业化生产。
参考文献：
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（文章来源：《中国兽医科学》（下）；第37卷；增刊2007：1035~1037）
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