BHK21 细胞低血清培养基的适应和低血清培养
刘学荣，董文教，宋玉霞，牟会琴，王晶，王国燕，董金杰，陈苗苗，牟克斌，黄银君
（中农威特生物技术股份有限公司，甘肃兰州 730046 )
摘要：本研究选用商业化的低血清培养基 MEM SLM ，以D201培养基＋10%血清培养的细胞为对照组，采用分阶段驯化法驯化 BHK21 细胞适应 MEM SLM ，当细胞的比生长率、细胞数量等参数与对照组相近时，则认为细胞驯化成功，在此基础驯化细胞适应低血清培养环境。结果显示细胞在驯化初期细胞很难适应 MEM SLM，在5～6代后细胞逐渐适应 MEM SLM，细胞比生长率和细胞活性与对照组相近；在低血清培养驯化过程中发现，用MEM SLM培养BHK21细胞时仍需添加一定量的血清。并筛选出能稳定传代、繁殖较快、能适应大规模生产需要的细胞，建立生产用细胞种子库。
关键词： BHK21 细胞；低血清培养基；低血清培养
动物细胞大规模培养广泛应用于抗体药物、基因治疗药物、疫苗以及基因工程药品等生物制品的生产，目前主要采用最基础的合成细胞培养基，甚至天然培养基（如水解乳蛋白）加入10％左右新生牛血清，在转瓶中培养细胞。但是这些动物来源成分带来的安全、质量和成本等问题已经突显。主要表现在：①牛血清用量大，使细胞的生长状况对血清的依赖性大，而血清都是一种成分不确定的混合物，批与批之间的组分存在差异，直接影响产品质量的稳定性；②增加生产成本；③血清来源于动物，有可能携带传染源，对正在生长的细胞或者产品带来危险。在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国FDA和美国农业部已经严密控制在细胞培养中胎牛血清的使用，以降低动物血清可能携带的传染源对细胞和制品带来的风险。
随着对血清成分和性能的研究，人们对血清中的主要成分如激素、生长因子、结合蛋白以及贴壁和扩展因子的性质和作用有了较全面和正确的认识，将血清中大部分营养成分用化学成分明确的营养物质如氨基酸等组合取代，开发研制了许多低血清培养和无血清培养基。本研究选用一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞，观察细胞的生长情况，并筛选出能稳定传代、繁殖较快、能适应大规模生产需要的细胞，建立生产用细胞种子库。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞 BHK21细胞112代，使用50% MEM + 50％乳汉液加10％新生牛血清的传统培养基培养，购自中国兽药监察所，由中农威特生物技术股份有限公司质量保证部保存，按常规组织培养法进行培养和传代。
1.1.2 培养基 MEM 细胞培养基为GIBCO公司产品，MEM SLM低血清细胞培养基为北京清大天一生物技术有限公司产品，水解乳蛋白为 HYCLONE 公司产品。201细胞培养液50 % MEM十50％乳汉液）由中农威特生物技术有限公司生产部配制、过滤除菌。新生牛血清为兰州民海生物技术公司产品。
1.1.3 设备 培养容器为3L转瓶、100mL方瓶、500mL方瓶，均为国产设备。
1.2 方法
1.2.1 将复苏的BHK21 (112代）在 T75 的培养瓶中使用201 培养基（50 % MEM + 50％乳汉液加10％新生牛血清）培养3代，备用。
1.2.2 驯化细胞 细胞来自用传统培养基培养的 BHK21细胞，细胞的驯化采用两个步骤。 ①驯化细胞适应MEM SLM 培养基，首先在不降低血清用量的情况下驯化细胞适应低血清培养基，逐渐降低201培养基的含量、增加低血清培养基的含量。驯化过程采取201 细胞培养液加10 ％血清培养的细胞对照，以比生长速率为主要指标，直至细胞完全适应，细胞生长状态与对照组姻似。 ② 驯钻细胞适应低血清环境，低血清适应过程也采用方瓶在 37℃ 静态培养，分阶段逐渐降低血清的用量。
1.2.3 生产用细胞种子库的建立 将适应低血清培养的细胞进行筛选，保留生长较快、传代稳定性较好、生长密度较高的细胞，保存各个代次的细胞种子，建立生产用细胞种子库。
1.2.4 细胞计数 台盼蓝染色，用血球计数板计数板。细胞密度与细胞活性的计算方法为：活细胞密度=平均每大格活细胞数×104，细胞活性=（活细胞数／细胞总数）×100％。
1.3观察
每天用倒置显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。
2 结果
2.1细胞适应 MEM SLM 低血清培养基的情况
BHK21细胞直接由201培养基十10％新生牛血清转人MEM SLM+5％新生牛血清时，细胞表现出不能适应新的培养基，出现贴壁延迟1～2h，贴壁后不分裂繁殖，24h后大部分细胞从瓶壁脱落。
表 1 BHK21 细胞适应 MEM SLM 的生长情况
| 培养基 | 201 培养基 | 50 % 201 + 50 % SLM | 25 % 201 + 75 % SLM | MEM SLM | |||||
| 小转瓶 | 大方瓶 | 小转瓶 | 大方瓶 | 小转瓶 | 大方瓶 | 小转瓶 | 大方瓶 | ||
| 新生牛血清 | 10% | 10% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% | |
| 分种比例 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | 1:5 | |
| pH （接种时） | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | |
| 贴壁比例 | 24h | 50% ～ 60 % | 50%～ 60 % | 60%～ 70 % | 60%～ 70 % | 60%～ 70 % | 60%～ 70 % | 60%～ 70 % | 60%～ 70 % |
| 48h | 90% | 90% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| 72h | 100% | 100% | 大多数细胞开始老化，表面有大量死细胞 | ||||||
| 96h | 变圆，开始脱落 | 表面死细胞较多，但未脱落 | |||||||
| 长成单层时间 | 72h | 72h | 48h | 48h | 48h | 48h | 48h | 48h | |
| 细胞数量(108) | 0.8～0.9 | 4～5 | 0.8～0.9 | 4～5 | 0.6～0.7 | 3～4 | 0.6～0.7 | 3～4 | |
本试验采取分阶段适应的方法，分四个阶段逐步使细胞适应MEM SLM，在替换培养基的初期，细胞也有不适应的表现，与对照组相比，细胞的生长延迟期明显变长；细胞活性由 90％降到40％。细胞还可能出现大量死亡，不能继续传代等异常现象。但在维持5、6代后，细胞逐渐恢复正常，当细胞的比生长率、细胞数量等参数与对照组相近时，则认为细胞驯化成功。
2.2 BHK21 细胞对低血清培养的适应情况
在驯化细胞适应 MEM SLM培养基的过程中，已将血清用量降到5 %，在此基础上开始降低血清用量，即5％→4 %→3% →2%→1 %，细胞在T75细胞瓶中的生长情况见表 2。
表2 BHK21 细胞适应低血清培养的生长情况
| 培养基 | 201 培养基+10%血清 | MEM SLM +5%血清 | MEM SLM+4%血清 | MEM SLM+3%血清 | MEM SLM+2%血清 | MEM SLM +1%血清 | |
| 分种比例 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:4 | 1:3 | |
| pH （接种时） | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | |
| 贴壁比例 | 24h | 60% ～ 70 % | 60%～70 % | 60%～70 % | 60%～70 % | 60%～ 70 % | 40%～ 50 % |
| 48h | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 70%～80 % | |
| 72h | 大多数细胞开始老化，表面有大量死细胞 | 100 % | |||||
| 96h | 细胞开始变圆，开始脱落 | ||||||
| 细胞数量(107) | 2 | 2.3～2.5 | 2.1～2.3 | 2～2.2 | 1.9～2.1 | 1.6～1.8 | |
| 细胞活性 | 92% ～95 % | 92%～95 % | 92%～95 % | 92%～95 % | 92%～95 % | 92%～95 % | |
| 连续传代次数 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 10 | |
2.3 细胞种子库的建立
选择 MEM SLM + 4％新生牛血清培养的细胞，并筛选出传代稳定性好、生长较快的细胞，得到121代的细胞，编号 BHK21Pll2-10，按常规方法冻存，供生产用。
3 讨论与结论
细胞由原培养基（乳汉液 50 % + 50 % MEM 混合液，含10％血清）改用 MEM SLM 低血清培养基后，细胞对新的培养基要有适应过程，细胞可能出现生长缓慢、贴壁性差、形态异常等不适应的表现，这时要根据细胞的生产情况，采取相应的措施，使细胞度过适应期，这个适应过程一般需要5～6代。原培养基和 MEM SLM 的成分有所不同，再加上 MEM SLM 中添加了部分血清成分的替代品，细胞可能要改变某些代谢途径或代谢方式，所以需 要一定时间。当细胞的比生长率、细胞数量等参数与对照组相近时，则认为细胞驯化成功。
在阶段性降血清过程中，在最初的3代细胞没有表现出不适应现象，但在继续传代的过程中发现，添加 2％以下血清量的细胞，活性显著下降、贴壁性差、比生长率降低，很难继续传代。在细胞适应低血清培养的过程中，细胞出现了明显的反应滞后现象，这可能是由于细胞自身的能量积蓄，导致对外界环境变化的不敏感性，在血清用量较少（小于2%）的情况下，当细胞消耗完这些能量积蓄后，细胞则表现出对低血清环境的不适应。随着血清浓度的降低，细胞的比生长率和细胞活性都有所下降，反映了血清的保护作用被削弱，而低血清培养基 MEM SLM 中的添加物成分有限，还不能完全替代血清中那些已知或未知的有用成分的作用，可能导致细胞内部某些关键酶的合成途径被阻断，使一些代谢途径被阻塞或膜的合成困难。由此看来，本试验所用的低血清培养基 MEM SLM，虽然添加了某些血清成分的替代品，但这些添加成分的种类和数量都有限，只能在一定程度上降低血清的用量。
综上所述，本试验所用的低血清培养基MEM SLM，只有在添加2％以上的血清量时，才能用于 BHK21 细胞的大规模培养，该培养基的使用，能够降低 BHK21 细胞的生产成本。
参考文献：
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[2] 张卓然.实用细胞培养基[M].人民卫生出版社.
[3] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].科学出版社.
[4] 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术[M].北京出版社.
[5] 黄斌, 牛红星等.rCHO细胞无血清适应及悬浮培养[J].华东理工大学学报, 2004,30(1):38-42.
（文章来源：《中国兽医科学》（下）；第37卷；增刊2007：1030~1032）
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