慢病毒生产及使用操作手册
三、包装细胞293T 细胞的培养
（一） 293T 细胞的冻存
随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
（二）293T 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
（三）293T 细胞的复苏
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。
四、慢病毒包装和浓缩1ug/ul,A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。
（二）传293T 细胞
将培养293T 细胞T75 瓶中的培养基吸净，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37 度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中预热的10% DMEM，移液枪用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10% DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4
大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000 万/T75；若第三天转染，铺350-400 万/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。
（三）做脂转complex成分如下：
pspax 10μg
PMD2G 10μg
pLVX-IRES-ZsGreen1-TKT-L1 10ug
转染后6h 换新鲜培液。
（四）病毒收集
转染后24 和48h 分别两次收集病毒上清(24h 收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 μm 滤器过滤,于40 mL 超速离心管中，4℃，72000g/min 离心120 分钟；
（五）病毒重悬和保存
500ul PBS 重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 度冰箱保存，如需长时间存放需置于-80 度甚至液氮保存。
五、感染目的细胞
因为不同细胞的MOI 不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的病毒数以及在感染的时候是否需要加入辅助增强剂Polybrene。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24 孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
（二）病毒感染
感染实验分为两组，一组是直接添加相应慢病毒载体和等滴度同体积的对照病毒载体，另一组同时添加polybrene。加入的病毒量范围在 MOI=20～50 内，每个MOI 值加两个孔，加入感染增强剂polybrene的一组使polybrene 最终浓度为5ug/ml, 24 小时后换液。（具体加入的病毒数可参考附表）
（三）48 小时后观察荧光表达情况,根据细胞的MOI 值确定是否需要加入Polybrene。