慢病毒包装———架起基因和功能研究的桥梁

细胞感染方法

   2013-03-18
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(一)细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞浓度为 1×105/ml 细胞,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同, 一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50%至70%之间。
(二)病毒感染
1.感染细胞最佳MOI 的测定MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指每个细胞感染的病毒数,通常MOI 越高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞,比如 Hela、293 细胞,MOI=1~3 时,80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验,选择适合的MOI 进行实验。
2.感染步骤
按实验需要将细胞铺板(比如12孔板);细胞数以第2天密度约50%为宜;37℃ 培养过夜。
对于Polybrene 可施加的细胞:准备完全培养基和 Polybrene混合物,Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中(适用于24 孔板,其他孔板请相应调整体)。
对于不适用 Polybrene 的细胞,以上步骤省略,直接进入下面步骤:
感染前,从冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒,吸去细胞原有培养基,将病毒原液加入细胞中,轻轻8字混匀。感染后第二天(约12小时),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续37℃培养。感染后48小时,对于带 GFP报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测GFP表达效率,对于携带 Puromycin抗性基因的病毒,换上含适当浓度的 Puromycin 的新鲜完全培养液,筛选稳定转导的细胞株。

编辑: snail    来源:丁香园

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