又是一年实习季,实验室里出「奇迹」,我碰上了一位「十万个为什么」师妹:
师妹:师兄,导师让我分离一例病患血液中的淋巴细胞,是罕见的淋巴系恶性增生性疾病, Percoll 和 Ficoll 怎么选呀?Ficoll 分离人外周血中淋巴细胞,血液样品和 Ficoll 的比例这么设置可以吗?离心出来这么多层,白膜层在哪里? (C 位师兄的实验结果 VS Emo 师妹的实验结果)
...... 师兄: 你这样的人(ben)才(dan)到底怎么考上医学院的? 来,我一次给你讲清楚......(师兄内心 OS:看你拿着样本这么发愁,终究还是心软了) 人淋巴细胞的普遍来源是外周血,分离目标是:收率越高越好,纯度越高较好,活性越高越好。要达到这个要求,整个实验过程要手稳、温度稳、设备稳,缺一不可。
根据血液中细胞量的不同(红细胞和粒细胞的密度大约1.090 g/mL;淋巴细胞和单核细胞密度在 1.075~1.090 g/mL;血小板的密度在 1.030~1.035 g/mL),一般会采用离心手段从人外周血或脐带血中分离淋巴细胞。
实验室分离淋巴细胞的实验步骤
淋巴细胞分离步骤
1. 实验开始前先启动离心机预冷功能,设置预冷温度为 20°。将离心机升降速调整为缓慢降速. 防止停止过程过快造成分层样品的重悬,分层不清晰。切记!
2. 血液要新鲜,2 个小时以内分离最好,抗凝全血要用等体积的 PBS 稀释。稀释后的血液缓慢平铺到等体积的 Ficoll 分离液上方,注意保持两液面界面清晰。
3. 将铺设好样品的离心管放置于离心机中,中心对称放置。设定离心条件:温度 20℃,相对离心力 400 x g,离心时间 30 min。
4. 离心后将出现明显的分层:上层是稀释的血浆层,中间是透明的分离液层,血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层,离心管底部是红细胞与粒细胞(如下图)。
5. 小心的吸取白膜层细胞到离心管中,10 mL PBS 洗涤白膜层细胞,温度 20℃,相对离心力 400 x g,10 min。
6. 弃上清,5 mL 的 PBS 重悬细胞,温度 20℃,相对离心力 400 x g,10 min。
重复「step 6」1 次,弃上清,细胞重悬备用。 师妹:这就结束了吗? 师兄:No Way!一些血小板和单核细胞可能会与淋巴细胞集中于一层,若有必要进一步分离纯化,可用 MACS(磁珠活化细胞分选)或 FACS(荧光激活细胞分选)等方法,以特异的淋巴细胞亚群为指标,进行正交筛选。 师妹:这也太复杂了,今天的晚饭又变成宵夜了? 师兄:你今天走运,实验室刚采购了一台新的离心机,一键式离心条件设置,温度控制特别精准,据说还可以省去缓慢降速时的等待时间,降速从 0 档调到 3 档,整个 PBMC 分离实验时间直降 > 50%! 师妹:真方便,这可大大节约了我们科研民工的时间啊~简直是心巴上的离心机。 新离心机很宝贝的,操作要点我还是要再唠叨一下,马虎不得。 师兄:为了更大程度节约科研人的时间和提高分离细胞的效率,Eppendorf 提供一站式离心解决方案,从主机选型,到转子、适配器、离心耗材以及服务选择,一键开启,轻松离心。今天为大家介绍一款高效分离 PBMC 的冷冻离心机套装,还有「小师妹」的实验结果支持:采用 5910 Ri 多功能台式冷冻离心机的快速分离 PBMC 检测样品(实验方案)
5910 Ri 智能台式多功能冷冻离心机 PBMC 分离套装:
具有 Eppendorf 一贯精准、稳定的温度控制表现,再也不用担心对温度敏感的样品有损耗。低噪音低振动表现,帮助更快更稳的完成分离,不再被样品分层模糊、回收困难等问题所困扰,同时让工作环境更安静,挑战高难度 PBMC 分离,有 5910 Ri 可以轻松拿捏。
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高度通用的 Eppendorf 5910 Ri 冷冻离心机 10 种不同离心转子,适配多种类型离心管,如检验科常见的采尿管、各规格采血管、15/50 mL 离心管、175~1000 mL 离心瓶等,完美适配科研人的多种场景需求~ |