目的基因和工具载体确定和选择载体酶切依据对应的酶切体系进行酶切,琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带。 获取目的基因片段1) 引物设计和合成 2) PCR扩增目的基因片段 配置相对应的反应体系,轻轻混合均匀后置于PCR仪中进行反应,反应条件依据产物而定。琼脂糖凝胶验证PCR结构并回收产物。 PCR产物与载体进行同源重组使用的重组酶(Exnase II)完成重组,根据反应体系(10μl体系,见下表)进行混合配置,37℃金属浴15-30min,随后冰上冷却2min立即转化
注:载体:目的=1:3(摩尔质量比) 转化将交换反应产物加入100 μL感受态细胞中,轻弹管壁混匀内容物,冰浴30 min。42 ℃热激90 s,冰浴2 min。 加入500 μL的LB 培养基,37℃摇床震荡培养1 hrs。取适量菌液均匀涂布在含抗生素的平板上,恒温倒置培养12-16 hrs。 菌落PCR鉴定1) 根据目的基因设计鉴定上下游引物并合成 2) PCR鉴定 根据配制反应体系(20 μL体系,见表2)加样,置于PCR仪中进行反应。随后根据电泳结果判断是否转化成功。 表2 PCR鉴定反应体系
注:PCR反应条件根据引物GC含量而定,一般退火温度比引物Tm低5℃。延伸时间根据鉴定PCR产物长度而定,Taq Plus DNA聚合酶延伸时间按1 Kb/min计算。 测序将鉴定出的阳性克隆转化子转接至含抗生素的LB培养基中,37 ℃下培养12-16 hrs,取适量培养好的菌液进行测序。将测序结果与目的基因序列进行比较分析。 质粒抽提将测序结果正确的菌液转接至含抗生素的LB培养基中,37 ℃培养过夜,用质粒抽提试剂盒抽提质粒,电泳检测完成后进入下游实验。 布林凯斯(Brain Case)是一家专注于工具病毒载体研究及转化医学研究的高新技术企业。在过去的十多年时间里,以揭秘“大脑黑匣子”为己任,一直致力于工具病毒载体开发及应用策略研究,在神经环路示踪工具病毒载体(RV、PRV、HSV、VSV、CAV等)、疾病基因治疗用重组腺相关病毒(rAAV)载体研究、肿瘤免疫治疗用溶瘤病毒等研究积累丰富经验,发展了行业领()先的制备系统。 布林凯斯(Brain Case)现有70+人的研发及技术团队,硕博研究生率超45%,拥有20多项自主知识产权,已建成全流程的GMP生产及实验平台,在深圳、武汉和苏州建有完善的实验平台。公司开展基于神经环路研究和病毒载体技术的基础科研和药物研发服务。 如您有相关需求或想了解更多产品和服务 本文未经授权禁止转载 |