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精子冻存是一种动物种质资源保存的有效手段,原理是通过低温处理的方式使精子的新陈代谢活动被降低或抑制从而延长其保存时间。狭义上的精子冻存方法是将采集的精液(大动物一般是活体采集精液,小鼠等试验动物一般是处死后采集精液)经过初步处理后放入到冻存保护液中,混合均匀后装载到适当的容器里,以一定的速率降温(缓慢降温如程序冻存,快速降温如玻璃化冻存)到特定温度,当通过一定的方式重新恢复至生理温度时,精子又能复苏到正常的生理状态,并且能保持一定的活力及受精能力。 通过精子冷冻保存,可降低常规繁育方式对人力、物力和空间的强制需求,也可避免动物繁殖过程中潜在的种系退化、遗传漂移和自然灾害等威胁。 精子冻存的原理: 精子内是有水分的,冷冻保存过程中随着温度的降低,水会结成冰,然而过多过大冰晶的形成会导致精子内渗透压的改变以及刺伤膜结构,对精子造成致死性损伤。因此精子冷冻保存的关键是防止在降温或者解冻的过程中大量冰晶的形成,冻存保护剂由此而生,冷冻保护剂分子量大,无法通过细胞膜,冷冻过程中随着温度的降低,精子细胞外液中的水分结冰使渗透压升高,精子内的水分渗透至精子细胞外,造成自身细胞不断的脱水,使胞内冰晶形成减少,达到冷冻保护的目的。 精子冻存的应用: 1.精子冷冻保存在实际生产应用中可以打破时间、空间限制,方便国际及国内两地间运输和品种交流。 2.延长了动物遗传资源的使用时间,在保留优质遗传物质、精子库的建立和引入新物种等方面均具有重要意义。 3.通过精子冷冻保存可避免动物繁殖过程中潜在的种系退化、遗传漂移和自然灾害等威胁。 4.精子冷冻保存特別适合单基因编辑小鼠,复苏时和野生型背景鼠或者某遗传工程小鼠可直接IVF得到后代。 精子冻存的注意事項:
1.在分离附睾时,附睾不能沾到酒精。
2.一个品系进行精子冻存时应至少冻存2只适龄小鼠(12-18w),选择优质的附睾,附睾中的小管应充满精子呈不透明状。
3.冻存不同小鼠精子时,使用酒精消毒器械。
4.使用麦管吸取HTF和精子悬液时,需要控制HTF与精子悬液的距离和精子悬液与另外一侧封口处的距离。
5.精子冷冻完成后,至少复苏两管以观察冻存的精子的活力。
精子冻存的步骤:1.往培养皿中加入2mL HTF受精液,覆盖矿物油,置于细胞培养箱中过夜平衡。 图1 冷冻保存液高滴和冷冻保护剂液滴 3.脱颈法处死雄鼠,腹部用75%酒精消毒后,剪开皮肤和腹膜,小心拉出睾丸,分离附睾,放入培养皿中用眼科剪分离脂肪、血管和韧带等组织。将附睾放入提前预热的100 μL的冷冻保护剂液滴中,轻柔清洗附睾。 4.将附睾转移至冷冻保护剂高滴中,用1 mL注射器或剪刀划开附睾,置于热台或细胞培养箱中5~10 min,待精子流出后,将组织去除,用移液器轻柔吹打使精子和冷冻保护剂充分混合。 图2 冷冻保存液高滴中精子从附睾游出 5.将0.25 mL麦管通过麦管连接器与1 mL注射器连接(麦管连接器:去除1 mL注射器针头,将200 μL黄枪头尖端插入注射器,将麦管插入黄枪头),吸入约100 μL HTF培养液,吸入1 cm空气,再吸入10 μL左右精子悬浮液,最后再吸入空气,用麦管封口机热封口。(没有封口机可用金属镊子烧红后夹住封口)。 图3 麦管连接器示意图 图4 精子冻存麦管 6. 在泡沫盒中倒入液氮,液氮液面距离泡沫盒最上缘约5-10 cm,将麦管平放在泡沫盒边缘,液氮蒸汽预冷10分钟后用金属镊迅速将麦管浸入液氮中。 复苏步骤:
1.将麦管从液氮罐中取出,迅速移到水浴中37℃解冻15 min。
2.从水浴中取出麦管,纱布擦干表面,将两端封口处剪开,通过连接管与1mL注射器连接,将精子悬液打入已经预热平衡好的200 μL HTF培养液滴中,置于CO2培养箱获能50分钟。3.冷冻复苏精子的体外受精,请参考本公司小鼠IVF技术资料。 斯莱克景达实验动物有限公司拥有10年以上屏障动物房管理与运营的经验,我们具有完善的质量管理体系,严格遵循饲养繁育和动物安全管理操作流程,严密监控屏障内环境,定期检测实验动物和环境微生物,保障实验动物健康,为您的实验数据提供更可靠的保障。 斯莱克景达实验动物有限公司可提供以下技术服务:快速繁育服务,自然繁育服务,饲养服务,冻存、保种、复苏、生物净化服务,基因型鉴定服务、疾病模型小鼠构建、荷瘤鼠构建等。 对我们的服务感兴趣?快来拨打0731-84876042向专业技术人员咨询吧! 参考资料:
[1] 高嫚. 不同因素对小鼠冷冻精子体外受精的影响[D].东北农业大学,2019.
[2] Sato T, Katagiri K, Gohbara A, et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 2011;471(7339):504-507.
[3] Kumar A, Prasad JK, Srivastava N, Ghosh SK. Strategies to Minimize Various Stress-Related Freeze-Thaw Damages During Conventional Cryopreservation of Mammalian Spermatozoa. Biopreserv Biobank. 2019;17(6):603-612.
[4] Raspa M, Fray M, Paoletti R, et al. Long term maintenance of frozen mouse spermatozoa at -80 °C. Theriogenology. 2018;107:41-49.
[5] Mochida K, Hasegawa A, Shikata D, et al. Easy and quick (EQ) sperm freezing method for urgent preservation of mouse strains. Sci Rep. 2021;11(1):14149.
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