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可能原因 1:引物问题(包括:引物设计较差,引物合成较差,引物浓度太低)。 解决方法:设计引物的时候,避免在引物 3'端含有互补序列;避免可以形成内部发卡结构的序列;设计 Tm 类似的引物。针对引物合成的问题,用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。 可能原因 2:探针问题。 解决办法:就要用到我们前面提到的序列分析了。用 blast 对探针序列进行比对,设计符合要求的探针。 可能原因 3:模板问题(包括:模板质量不好,模板浓度太低)。 解决方法:提高模板质量。如果怀疑模板被 DMSO 等抑制剂污染了,坚决采用乙醇沉淀;使用 104copy 的靶序列,然后在 25 到 30 个循环中获得信号。 可能原因 4:不明物干扰。 解决办法:做 RT-PCR 必须非常小心翼翼。对 RT-PCR 的任何实验样品或试剂,均应采用“三无”离心管(即无菌无酶无热源)进行试剂的分装和使用。 可能原因 5:扩增酶问题。 解决办法:不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。推荐:选择hot start Taq 酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素。 中科腾宇(广州)科技技术有限公司是一家专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。 总部设在广州,服务全国。可以在第一时间为用户提供最前沿的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持,深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴,中科腾宇(广州)科技技术有限公司非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商,公司出资存备了大量现货,配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持,随时为客户提供服务。 |