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一、细胞简介 人口腔角质细胞HOK-16B取自女性供体,贴壁培养。 细胞名称:人口腔角质细胞HOK-16B 平台编号:zl-040906 二、细胞复苏操作说明 1.从液氮罐中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,移液枪吸出细胞悬液,加到离心管并滴加5倍以上完全培养基并混匀。 3.操作离心,调至1000转/分,时长10分钟 4.弃去上清液,重悬离心管底部细胞沉淀,在T25培养瓶中加入5-6ml完全培养基,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养。 5.次日更换一次培养液,继续培养。 6.注意:冻存细胞建议三管一起复苏到一个T25培养瓶中 三、细胞传代操作说明(贴壁细胞) 1.细胞于培养箱中,愈合度达到80%,可进行传代。 2.按T25培养瓶计,吸出完全培养基,并PBS缓冲液轻冲3遍,添加0.25%含EDTA胰酶2ml,消化2min(具体时间视细胞而定),后用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min离心10 min,弃上清收集细胞,铺至2个T25培养瓶中培养,各添加7ml完全培养基。 3.注意:消化时间不易过长,消化前血清成分务必去除干净,终止消化请用新鲜完全培养基,原瓶培养基不可继续使用(终止消化或传代)。 四、细胞传代操作说明(悬浮细胞) 1.细胞于培养箱中,密度达到悬浮细胞传代标准(沉降后可铺满底面),可进行传代。 2.按T25培养瓶计,吹打均匀,吸出完全培养基,1000r/min离心10 min,弃上清收集细胞,铺至2个T25培养瓶中培养,各添加7ml完全培养基。 3.注意:原瓶培养基不可继续使用(传代)。 五、细胞冻存操作说明 1.取待冻存的细胞(按T25计)用0.25EDTA胰酶2ml消化2min,用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min离心10min,弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞,则可直接离心收集细胞。 2.加入1ml冻存液(90%FBS+10%DMSO)制成细胞悬液。 3.细胞悬液装入3支冻存管中。 4.冻存管在4℃下存放30 min,转放-20℃1.5~2 h,再转人-70℃4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃),并登记。 六、参考文献 PubMed=1654226;DOI=10.1093/carcin/12.9.1627 Park N.-H.,Min B.-M.,Li S.-L.,Huang M.Z.,Cherick H.M.,Doniger J. Immortalization of normal human oral keratinocytes with type 16 human papillomavirus. Carcinogenesis 12:1627-1631(1991) PubMed=1330348;DOI=10.1093/carcin/13.11.1981 Li S.-L.,Kim M.S.,Cherrick H.M.,Doniger J.,Park N.-H. Sequential combined tumorigenic effect of HPV-16 and chemical carcinogens. Carcinogenesis 13:1981-1987(1992) PubMed=10675494;DOI=10.3892/ijo.16.3.591 Itakura M.,Mori S.,Park N.-H.,Bonavida B. Both HPV and carcinogen contribute to the development of resistance to apoptosis during oral carcinogenesis. Int.J.Oncol.16:591-597(2000) PubMed=12907203;DOI=10.1016/S1368-8375(03)00049-6 Swan E.A.,Jasser S.A.,Holsinger F.C.,Doan D.,Bucana C.D.,Myers J.N. Acquisition of anoikis resistance is a critical step in the progression of oral tongue cancer. Oral Oncol.39:648-655(2003) PubMed=21868764;DOI=10.1158/1078-0432.CCR-11-0690 Zhao M.,Sano D.,Pickering C.R.,Jasser S.A.,Henderson Y.C.,Clayman G.L.,Sturgis E.M.,Ow T.J.,Lotan R.,Carey T.E.,Sacks P.G.,Grandis J.R.,Sidransky D.,Heldin N.-E.,Myers J.N. Assembly and initial characterization of a panel of 85 genomically validated cell lines from diverse head and neck tumor sites. Clin.Cancer Res.17:7248-7264(2011) 七、验收细胞注意事项 1、收到人口腔角质细胞HOK-16B,请查看瓶子是否有破裂,培养基是否漏出,是否浑浊,如有请尽快联系。 2、收到人口腔角质细胞HOK-16B,如包装完好,请在显微镜下观察细胞。,由于运输过程中的问题,细胞培养瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来,显微镜下观察会出现细胞悬浮的情况,出现此状态时,请不要打开细胞培养瓶,应立即将培养瓶置于细胞培养箱里静止3-5小时左右,让细胞先稳定下,再于显微镜下观察,此时多数细胞会重新贴附于瓶壁。如细胞仍不能贴壁,请用台盼蓝染色法鉴定细胞活力,如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方法处理。 3、收到人口腔角质细胞HOK-16B后,请镜下观察细胞,用恰当方式处理细胞。若悬浮的细胞较多,请离心收集细胞,接种到一个新的培养瓶中。弃掉原液,使用新鲜配制的培养基,使用进口胎牛血清。刚接到细胞,若细胞不多时血清浓度可以加到15%去培养。若细胞迏到80%左右,血清浓度还是在10%。 4、收到人口腔角质细胞HOK-16B时如无异常情况,请在显微镜下观察细胞密度,如为贴壁细胞,未超过80%汇合度时,将培养瓶中培养基吸出,留下5-10ML培养基继续培养:超过80%汇合度时,请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞,吸出培养液,1000转/分钟离心3分钟,吸出上清,管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。 5、将培养瓶置于37℃培养箱中培养,盖子微微拧松。吸出的培养基可以保存在灭菌过的瓶子里,存放于4℃冰箱,以备不时之需。 6、24小时后,人口腔角质细胞HOK-16B已恢复并贴满瓶壁,即可传代。(贴壁细胞)将培养瓶里的培养基倒去,加3-5ml(以能覆盖细胞生长面为准)PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化,消化时间以具体细胞为准,一般1-3分钟,不超过5分钟。可以放入37℃培养箱消化。轻轻晃动瓶壁,见细胞脱落下来,加入3-5ml培养基终止消化。用移液管轻轻吹打瓶壁上的细胞,使之完全脱落,然后将溶液吸入离心管内离心,1000rpm/5min。弃上清,视细胞数量决定分瓶数,一般一传二,如细胞量多可一传三,有些细胞不易传得过稀,有些生长较快的细胞则可以多传几瓶,以具体细胞和经验为准。(悬浮细胞)用移液管轻轻吹打瓶壁,直接将溶液吸入离心管离心即可。 7、贴壁细胞,悬浮细胞。严格无菌操作。换液时,换新的细胞培养瓶和换新鲜的培养液,37℃,5%CO2培养。 特别提醒:原瓶中培养基不宜继续使用,请更换新鲜培养基培养。 |