大家都在搜
研究内容:1. B7-H3在人癌组织和细胞系中的表达本研究采用流式细胞术和免疫共沉淀法,用抗B7-H3 IgG 8H9检测了B7-H3在不同癌细胞系中的表达。流式分析结果显示除B7-H3阴性细胞(Daudi)外,B7-H3高表达于例如A549,NCI-H23,HCC827,DLD-1,HCT-116,和MDA-MB-231等多种癌细胞表面。蛋白印迹结果进一步证实,8H9抗体从A549和NCI-H23而非Daudi的全细胞裂解液中免疫沉淀出约为100kDa的4Ig-B7- H3蛋白。免疫组化结果显示8H9抗体和商用抗B7-H3抗体在人非小细胞肺癌组织中检测到B7-H3,在肺正常组织中未见阳性染色。以上结果表明B7-H3在人实体瘤细胞系和组织中高表达。8H9抗体对B7-H3表现出较强的反应性,但对正常组织无交叉反应性,因此8H9抗体被选用于CAR的构建。图1:B7-H3在肿瘤细胞系和原代人体组织上的表达 2. 携带抗B7-H3 CAR的NK-92MI细胞的生成抗B7-H3 scFv由(G4S)3接头将抗B7-H3抗体8H9的轻链和重链可变区连接而成。抗B7-H3 CAR构建体由抗 B7-H3 scFv、CD8 TM 区、4-1BB和CD3 ζ 胞内结构域组成。将CAR DNA序列插入到与ZsGreen 共表达的pLVX慢病毒载体中,随后产生慢病毒颗粒并转导入人NK-92MI细胞中,转到效率为24.9%。经过几轮分选,表达CAR的NK-92MI细胞百分比超过了95%。抗B7-H3 CAR的表达用qPCR检测,结果显示,与未转导的NK-92MI细胞相比,CAR在转导的NK-92MI细胞中高表达。 图2:B7-H3 特异性CAR-NK-92MI细胞的生成 3. CAR-NK-92MI细胞对B7-H3阳性肿瘤细胞系的细胞毒性增强为了确定B7-H3识别是否能提高NK-92MI的细胞毒性,我们通过 Calcein-AM实验比较了CAR-NK-92MI细胞和未修饰的NK-92MI细胞对一组人肿瘤细胞系的反应。结果显示,未修饰的NK-92MI细胞相比,CAR-NK-92MI细胞在所有E/T下的细胞毒性均显著增强。然而,对于MDA-MB-231,CAR-NK-92MI与未修饰的NK-92MI在1:1的低E/T下的有效性无显著差异,B7-H3阴性的Daudi细胞没有被任何NK-92衍生细胞裂解。未修饰的NK-92MI细胞对HCC827和MDA-MB-231 细胞系在高 E/T比下有中度杀伤作用,然而它们能被CAR-NK-92MI细胞裂解并具有显著性差异。这些细胞本质上对NK细胞敏感,与其他报道一致。总之,实验结果表明,CAR-NK-92MI细胞对B7-H3阳性肿瘤细胞具有特异性的细胞毒性。图3:B7-H3 CAR-NK-92MI 细胞对一组肿瘤细胞系的体外细胞毒性测定 4. CAR-NK-92MI细胞响应B7-H3阳性靶细胞的活化升高NK细胞活化的一个标志是脱颗粒,其中裂解颗粒内容物(穿孔素和颗粒酶)被释放到靶细胞表面。CD107a、颗粒酶B、穿孔素是脱颗粒的三个主要标志物。为了进一步分析CAR-NK-92MI细胞的脱颗粒,我们通过流式细胞术分析了CD107a的表达和颗粒酶B、穿孔素的分泌。CAR-NK-92MI细胞分别与A549、NCIH23细胞以E/T为1:1共培养24h,结果显示,相比于未修饰的NK-92MI细胞,CAR-NK-92MI细胞表面CD107a的表达具有显著性差异。另外,B7-H3 CAR增强了在NK-92MI细胞脱颗粒中穿孔素、颗粒酶B的表达。在与靶细胞响应时,CAR-NK-92MI细胞中的颗粒酶B和穿孔素的水平显著上调。尽管A549细胞比NCIH23细胞表达更高水平的B7-H3,但是A549细胞中CD107a的水平似乎比NCIH23要低,这意味着溶细胞颗粒极化和脱颗粒不是由高于阈值的B7-H3密度决定的。我们假设不同受体控制两个细胞系的脱颗粒。因此,结果表明,脱颗粒激活在CAR-NK-92MI细胞的细胞毒性中起重要作用。图4:B7-H3 CAR-NK-92MI 细胞的脱粒和颗粒分泌 5. CAR-NK-92MI细胞在NSCLC移植瘤中的治疗效果为了评估体内抗肿瘤活性,建立了A549细胞皮下模型。植入10天后,三组A549细胞移植瘤小鼠分别接受静脉注射CAR-NK-92MI细胞(5x10^6/剂)、未修饰NK-92MI细胞(5x10^6/剂)和PBS在第10、17、24、31天。结果显示,在实验结束时,相比于NK-92MI组和PBS组,CAR-NK-92MI组分别缩小肿瘤体积52.1%、63.8%。CAR-NK-92MI组的存活时间显著长于PBS组和NK-92MI组。因此CAR-NK-92细胞有效抑制肿瘤生长和荷瘤小鼠的生存期。 图5:用B7-H3 CAR-NK-92MI细胞治疗NSCLC异种移植瘤 实验结论:在本研究中,我们构建了由4-1BB共刺激信号域和CD3ζ 结构域组成的第二代CAR,与目前临床使用的抗CD19 CAR-T细胞相似。本研究证实了抗B7-H3 CAR通过41-BB和CD3ζ 链的信号直接触发了NK细胞的溶解细胞功能。体外细胞毒性实验表明,CAR-NK-92MI细胞依据H7-B3的识别功能特异性地杀死肿瘤细胞。另外,CAR-NK-92MI细胞显著增强对所有B7-H3阳性细胞系的细胞毒性能力。抗B7-H3 CAR的重定向进一步增强了NK的活化和脱颗粒。脱颗粒是NK细胞活化的一个重要过程,它被触发脱颗粒释放溶解的颗粒分子,进而诱导靶细胞凋亡。除了穿孔素和颗粒酶B外,还观察到CD107a在CAR-NK-92MI细胞中显著上调。另外,在NSCLC移植瘤中,CAR-NK-92MI细胞显现出有效的抗肿瘤能力和延长荷瘤小鼠的生存时间。虽然CAR-NK-92MI缺乏长期的持久性,但是多次使用CAR-NK92MI细胞可以克服此缺点。因为辐射的CAR-NK-92MI细胞对于患者输注是确保安全所必须的,所以在CAR-NK-92MI细胞被应用于临床试验之前,我们需要进一步研究辐照对CAR-NK-92MI细胞内在特征的影响。总之,B7-H3可作为NSCLC治疗的靶点。抗B7-H3 CAR-NK-92MI在体内和体外显示出显著的治疗效果。我们的研究支持开发CAR修饰的NK-92细胞作为过继癌症免疫治疗的一种选择。
参考文献:Yang S, Cao B, Zhou G, Zhu L, Wang L, Zhang L, Kwok HF, Zhang Z, Zhao Q. Targeting B7-H3 Immune Checkpoint With Chimeric Antigen Receptor-Engineered Natural Killer Cells Exhibits Potent Cytotoxicity Against Non-Small Cell Lung Cancer. Front Pharmacol. 2020 Jul 30;11:1089. doi: 10.3389/fphar.2020.01089. PMID: 32848731; PMCID: PMC7406658. |