6月15日,Scilia联合丁香实验进行线上研讨会直播,Scilia高级科学家傅征博士带领大家了解了文库筛选在肿瘤免疫的研究前景以及前沿技术的应用情况。 本次直播中,傅征博士重点讲述CRISPR文库筛选技术,从 CRISPR 文库筛选技术的原理与应用,到技术理论实操技巧一网打尽。并在互动环节回答了来自线上听众的专业问题。
▲主讲嘉宾 Scilia高级科学家傅征博士
研讨会全程视频: 直播回顾|Scilia高级科学家讲述 CRISPR文库筛选技术一网打尽 (qq.com) ▲点击上方链接,观看研讨会全程视频
互动环节: 问:CRISPR文库筛选的成功率怎么样?周期一般要多久? 答:CRISPR文库筛选的成功率主要取决于一个好的筛选模型,接着就是严格按照protocol做实验。比如某种抗肿瘤药物,能够全部杀死细胞或者细胞完全对药物耐受,这样通过检测细胞活性,或其他一些明确的特征就比较容易进行筛选(如GFP或marker基因的表达等)。同时,这类显著的模型中,细胞需要对文库病毒具有易感性,也就是说越容易被慢病毒感染,筛选的成功率就越高。 实验周期分几个阶段:sgRNA设计及文库质粒制备和NGS质检,一般需要4-6周;文库病毒制备及滴度测定需要2周;在细胞模型上的正式筛选则取决于每一个筛选模型,可能2-3周不等;剩下的就是建库测序和结果分析,一般2-4周。
答:除了应用于肿瘤抗药性或药敏性基因靶点的筛选,CIRISPR文库筛选技术还经常被用于免疫细胞功能的关键调节分子筛选。如今天讨论到的2018年 Eric等发表在《Cell》上的Genome-wdie CRISPR Screens in Prmary human T cells reveal key regulators of Immune function,文章内容提到以细胞增殖为读数(readout),利用CRISPR文库筛选调控TCR信号的关键基因;以及2020年发表在《Cancer Discovery》上的CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies,2022年发表在《Nature》上的CAR-T cell Killing requires the IFNGR pathway in solid but not liquid tumors,文章内容均提到了用CRISPR文库在CAR-T细胞中筛选可以增强CAR-T杀伤的关键基因。 另外,CIRISPR文库筛选技术在发育研究中也有较大应用前景。比如2020年《Cell Systems》上发表的A single-Cell transcriptomics CRISPR-activation screen identifies epigenetic regulators of the zygotic genome activation program,该文章提到利用CRISPR文库筛选技术筛选调控合子基因组激活的关键分子。 总的来说,CIRISPR文库筛选技术的应用很大程度上取决于筛选模型,有一个好的筛选模型(比如发育中marker基因的表达等),就可以利用这个技术来筛选潜在的关键调控基因。 问:我们课题组研究离子通道的,你们可以给定制吗?目前Scilia可以提供哪些种类的文库筛选? 答:Scilia目前可以提供人或小鼠的全基因敲除文库。另外,也可以根据需求提供文库定制服务。 问:CRISPR整个流程关键环节怎么做的质控? 答:CRISPR文库筛选整个流程,我们会在各环节进行相应的质控,操作步骤和质控项较多,举例其中关键质控步骤,如文库质粒构建环节,我们的质控标准是克隆覆盖倍数确保在所定制文库sgRNA总数的500倍以上, NGS检测文库完整性>99.5%、均一性<10;病毒包装环节,我们严格执行在BSL2级实验室中进行病毒包装生产,提供的病毒滴度≥10^8 TU/mL 等。 问:刚才看到介绍有病毒包装,你们是自己做的吗?还是外包的? 答:Scilia拥有专业的病毒载体构建与包装平台,可以提供AAV腺相关病毒、LV慢病毒、ADV腺病毒等高质量的病毒载体构建与包装服务和多方位基因递送解决方案。 Scilia专注于为细胞与基因治疗(CGT)等领域的医药创新企业提供专业的综合研究服务与解决方案,凭借智能化和自动化平台,提供多种重大疾病领域的研发服务,更是提供了一站式CRISPR文库筛选方案,包括sgRNA文库定制、文库质粒构建与扩增、文库质粒慢病毒包装、 CRISPR文库筛选、高通量测序与生信分析及候选基因验证。选择Scilia CRISPR文库筛选服务,让您的研究工作省时、省力、省心!Scilia Life Science 微信扫一扫 |