呼吸系统疾病是战争引发的疾病中比较主要的一种,表现为症状多样性及多器官受累,尽管该疾病的许多潜在机制仍在探索,但慢性免疫功能障碍是比较明确的一个特征。2021年7月,美国匹兹堡大学医学院的研究人员发表了一篇题为 ‘Experimental respiratory exposure to putative Gulf War toxins promotes persistent alveolar macrophage recruitment and pulmonary inflammation’ 的文章¹,通过实验模拟海湾战争毒素(Gulf War Toxins, GWTs)暴露,利用多参数光谱流式细胞术、细胞因子分析等方法,对小鼠肺部免疫细胞组成和炎症反应进行评估,展开了战争毒素暴露引发的呼吸系统疾病的相关研究。 为深入了解GWTs暴露所带来的呼吸系统免疫反应及变化情况,研究者通过实验室模拟了两种毒素(DEP和malathion)的暴露,针对小鼠肺和支气管发肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage, BAL),利用5激光配置的Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪,设计了两个免疫分型方案,包括一个18色的基础方案和一个31参数(30色+自发荧光)的全面分型方案。之所以会采用两个方案,是因为研究者考虑,在复杂的疾病模型中,细胞表型的变化很难用标准的先验定义的谱系来准确表示,为了更详细地描述假定的GWTs暴露对肺免疫组成的影响,研究者在18色基础方案的基础上,拓展了一个31参数的更为全面的免疫表型分析方案。由于肺泡巨噬细胞是肺黏膜的主要单核吞噬细胞,协调宿主对病原体和环境刺激的反应。研究者也将探索的重点放在了巨噬细胞上。方案中所使用的抗体详细信息请参考下表1。 表1-31参数光谱流式方案的试剂组成 光谱流式方案的设门策略如下图2所示,可分别鉴定出肺和BAL中表达CD11bLow CD11c+ CD64+ Siglec-F+的肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages, AlvMacs ),表达 CD11b+ CD64+ CD24– Siglec-F–肺间质巨噬细胞(Interstitial macrophages, IntMacs),以及,CD4+ T 细胞 (CD3+ CD4+),CD8+ T 细胞 (CD3+ CD8+), NK 细胞 (CD3– CD49b+ SSCLow),嗜酸性粒细胞 (Siglec-F+ CD11b+ CD64– CD11c– F4/80+ SSCHigh),中性粒细胞 (CD11b+ Ly6G+ CD11c– CD64– SSCHigh),树突状细胞 (CD11b+/– CD11c+ CD24+ CD64– MHCII+) 和单核细胞 (CD64Low CD11b+ Ly6CInt/+ CD11c– Siglec-F– ) 等细胞亚群。 图1-小鼠肺和BAL免疫分型方案设门策略 研究人员分析发现,在小鼠肺内和BAL中,无论是单独或组合的毒素暴露,AlvMacs ,IntMacs,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞等细胞群的总体比例都受到了不同程度的影响。其中,在malathion暴露组的BAL中,AlvMac比例降低和中性粒细胞比例升高尤为显著,且BAL的AlvMac还伴有显著的CD206(替代激活标记)和PD-L1(免疫抑制标记)表达增加,及CD86(传统炎症标记) 表达的降低,表明GWTs暴露可以促进肺巨噬细胞中替代激活标记和抑制性受体的表达,而不同毒素可单独或联合诱导独特的先天性免疫反应。GWTs暴露下不同细胞群的变化可参考图2。 图2-毒素暴露诱导的小鼠肺和BAL细胞免疫 利用高维免疫分型,来自肺和BAL的细胞分别被聚类为23个和24个细胞群,并可见GWTs暴露组的优势细胞群与对照组有明显的不同。无论是肺还是BAL样本,毒素暴露后的优势免疫细胞群都具有高表达Ly-6C,CD206,和Siglec-F (仅BAL) 的特征。提示单核细胞来源的巨噬细胞祖细胞在肺和BAL中的募集,是呼吸道GWTs暴露诱导的肺免疫改变的一个重要组成部分。(图3) 图3- 高维免疫分型-GWTs诱导的免疫反应(肺+BAL) 高参数光谱流式方案,为该研究的主要结论提供了关键的实验依据。正如研究者在文章中指出的 ,31参数的方案可以帮助他们更为详细全面的了解GWTs因素下的肺部免疫变化;同时受益于光谱流式特有的全光谱信号采集方式,相较于传统流式,研究者可以获得具有更高灵敏度的实验数据。光谱流式还可进行自发荧光去除,尽管文章未详细描述,但我们可以从31参数方案中洞察一二,由于实验的关键研究目标之一AlvMac是高自发荧光细胞,我们有理由相信光谱流式自发荧光去除的优势,对该研究关键实验数据的获得也做出了十分重要的贡献。
注:本文仅重点描述了该研究中与光谱流式相关的部分,文章的其他实验结论可参考原文进一步了解。 参考文献 1. Powers, Amy A., et al. "Experimental respiratory exposure to putative Gulf War toxins promotes persistent alveolar macrophage recruitment and pulmonary inflammation." Life Sciences (2021): 119839. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119839. |