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按人们的意愿去有目的地改造,创建生物遗传性,因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖,需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 理想载体要求: ①能在宿主细胞中复制繁殖,而且要有较高的自主复制能力。 ②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。每种酶的切位点只有一个。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作。 ⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。 质粒载体 简介: 质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的,能自主复制的,与细菌或细胞共生的遗传成分。 特点: ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA(covalently closed circuar DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300 kb之间,15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制,是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类:严紧控制(stringent control)型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联,拷贝数较少,每个细胞中只有1个到十几个拷贝;另一类是松弛控制(relaxed control)型质粒,其复制宿主不偶联,每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制,不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制,称为附加体,例如细菌的性质粒就是一种附加体,它可以质粒形式存在,也能整合入细菌的DNA,又能从细菌染色质DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation),通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体,线粒体DNA也是环状双链分子,也有独立复制的调控,但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分,质粒也往往有其表型,其表现不是宿主生存所必需的,但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存,例如,细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因,如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因,这种质粒称为抗药性质粒,又称R质粒,带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的,而是共生的。医学上遇到许多细菌的抗药性,常与R质粒在细菌间的传播有关,F质粒就能促使这种传递。 |