你是否也常常为 RNA 提取感到困惑,每次提取都在不断接受各种挑战,例如 RNA 降解、低产率、低纯度以及 DNA 污染等等。此外,还会遇到各种各样的样品,却找不到一个普适的方法来解决。 今天,我们就给大家分享下 RNA 分离技巧,特别是最大限度地回收高质量、无 DNA 的 RNA 的实践经验。文末还有 RNA 技能专属福利,不要错过咯。
一、收集样品后稳定 RNA RNA 是不稳定的,极易降解。许多样品含有高水平的 RNase,会快速降解 RNA。为了使之最小化,最好在采集时稳定样本中的 RNA。常用的样品稳定方法包括液氮快速冷冻、干冰乙醇浴或 -80 °C 冷冻室。然而,这些方法也有缺点,如核酸的冻融损伤。 最佳 RNA 稳定方法: 1.在裂解缓冲液中立即溶解,使 RNase 失活 (如 TRIzol®、RNA 裂解缓冲液等),然后样品可以立即处理或冷冻保存; 2.浸泡在稳定试剂中(如 DNA/RNA Shield),使核酸酶失活,并在环境温度下长时间保护核酸。适用于实地收集样本或处理珍贵的病人样本(例如组织活检、全血等)。二、确保样品完全溶解 在 RNA 提取过程中,提高 RNA 产量和质量的最佳方法是保证样品完全裂解。然而,并不是所有的样本都对相同的裂解方案敏感。例如,血细胞(如淋巴细胞、PBMCs 等)和微生物细胞往往很难有效溶解,仅仅添加基于洗涤剂的裂解缓冲液可能并不够。 为了提高裂解效果,可以将裂解缓冲液与机械裂解步骤(研磨珠破碎)匹配,或者在裂解液上游加入酶裂解步骤(如蛋白酶 K、溶菌酶等)(图 1)。
图 1:从裂解缓冲液中提取大肠杆菌细胞的总 RNA,用研磨珠机械匀浆,而不是仅用裂解液进行裂解。在裂解液中进行机械均质化可产生稳定的 28S/16S 核糖体带和更高的核糖体完整性(RIN)。Agilent2200 TapeStation®。
三、如何消除 DNA 污染
DNA 的存在会使基于 UV/VIS 的定量方法(如 Nanodrop)发生偏差,从而人为地提高 RNA 的定量,使其高于实际水平。
此外,在更敏感的下游应用(例如 RNA-seq)中,它还可能导致错误读数。这可以通过多种方法实现(例如 TRIzol® 相分离、DNA 去除柱和 DNase 处理)。
确认 DNA 的存在的最快方法是使 RNA 样本可视化(如琼脂糖凝胶,AgilentTapeStation® 等等), 寻找 28S 核糖体 RNA 带上方的任何高分子量片段(图 2)。其他方法 , 如 qPCR 或 Qubit 也可以使用,如果您正在执行对 DNA 污染敏感的下游应用,则更可取。
图 2:用琼脂糖凝胶电泳显示人类上皮细胞的 RNA 谱。使用 ZYMO RESEARCH 试剂盒提取的 RNA 没有污染基因组 DNA,与供应商 Q 和供应商 P 相比,小 RNA 的回收率更高。
Zymo Research 开发了一种新型的 RNA 提取试剂盒,该试剂盒具有新的缓冲液和离心柱体系,可以结合和提取 RNA,同时消除污染的 DNA。RNA 分离试剂盒包括用于柱上处理的 DNase I。
这消除了提取后 DNA 酶处理和清理步骤的需要,并简化了从提取到下游应用的过程。下面的图 3 说明了基于 PCR 缺乏 DNA 扩增,ZYMO 柱对 Dnase 处理是有效的。
图 3:使用 Zymo Quick-RNA 试剂盒(绿色)分离的 RNA 与使用供应商 Q 试剂盒(虚线)分离的样品相比无 DNA。从 106 个人上皮细胞中分离总 RNA(对于两种试剂盒均进行柱上 DNase 处理)。每条扩增曲线代表三次独立分离实验的平均值。
针对不同类型样本推荐的 RNA 产品:
四、配合 TRIZOL 试剂的 RNA 提取(含 microRNA) 本方法无需传统 TRIZOL 提取方法的相分离,而且不需要使用任何有毒有害的试剂(例如Chloroform),7 分钟就可完成整个操作步骤并且可以提取到含 microRNA 的总 RNA。
1.先用 TRIZOL 或类似试剂裂解样品 本表格针对各种样品列出了参考用量,详细用量请参见说明书
细胞样品
针对细胞重悬液,添加 3 倍体积的 TRIZOL 到 1 体积的细胞悬液中。
组织样品
液体样品
2.纯化过程 1.添加等体积的 100% 无水乙醇到 TRIZOL 的裂解物中混合; 2.把混合物加到 ZYMO-SPIN IIC 柱上并且套在收集管里,离心,去除滤出液; 3.可以采用柱上消化的 DNA 的步骤去除 DNA(可选); 4.添加 Direct-zol wash buffer 400 µL 到柱子上离心,去除滤出液; 5.添加 RNA wash buffer 700 µL 到柱子上离心,去除滤出液; 6.直接添加 50 µL of DNase/RNase-Free Water 到柱基质上,下面套上一个干净的 1.5 mL EP 管离心收集 RNA。
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