中枢神经系统研究的最大障碍之一是分子和细胞的异质性,为了理解不同类型的分子和细胞在中枢系统中如何发挥作用,必须标记和操控它们。最常用的研究手段是通过重组病毒技术,将标记基因和目的基因通过病毒携带进入细胞中,并改变其活性,利用重组病毒技术结合恰当的研究工具可以时空特异性的研究分子、细胞、环路和行为的关系。但由于病毒传递方式、感染特异性、细胞毒性、装载率等差异,针对特定的生物学问题选择正确的病毒工具尤为重要。本综述介绍了在神经科学领域可用的病毒工具的研究进展,并讨论了在哺乳动物神经系统中病毒特异性靶向的问题。
一、病毒工具的使用原则
关于重组病毒的使用,作者认为需要理解了6个关键的原则才能较好的设计和优化神经科学相关的病毒选择。 Figure1.神经科学中病毒载体使用的关键原则 1.病毒的包装和有效负载量(Packaging and payload):选择重组病毒首要的考虑因素是病毒的包装和有效负载量。病毒的基因组由DNA或者RNA组成,这些基因组装载到病毒颗粒后,要能再次将基因组结构打开并递送到细胞内。每一类病毒由于病毒基因组大小不一,能装载的核酸分子长度区别较大,并存在着包装极限的差异。 2.递送方式(Delivery):即病毒如何才能进入中枢系统。目前病毒递送的主流方式是通过立体定位注射,在一个或多个脑区注射不同的重组病毒,让不同的病毒发挥协同作用,达到实验目的。也可以通过将病毒通过尾静脉或者眼眶注射入外周血中,然后通过转基因鼠或特定的启动子元件来驱动病毒在不同类型的细胞中表达。 立体定位注射不同的病毒被细胞吸收的方式也存在差异。例如AAV、CAV和PRV三类病毒的局部脑区注射,AAV病毒通过感染神经元胞体将基因组递送入细胞内,而CAV和PRV则优先被神经末梢吸收,并从末梢逆轴浆运输传递到胞体中 。 Figure2.神经示踪标记神经元的病毒选择策略 3.趋向性(Tropism):即病毒到哪里去的问题,表现为病毒颗粒感染特定细胞的能力。要进入特定的细胞,病毒首先需要结合细胞上特定的受体,这些受体可以是蛋白质,也可以是脂质。特异性的受体通过内吞作用将基因组传递到细胞内。但需要注意的是一种病毒可以对应结合多种受体,而不同类型的病毒也有可能使用同一个受体分子。 4.遗传学操作(Genetic access):病毒遗传学信息的获取依赖于病毒颗粒与细胞的附着和基因组的输入与表达,针对病毒的特点进行遗传学操作可以达到预期的实验目的。例如不表达G糖蛋白的狂犬病毒(RbV)无法跨突触传递,利用重组的禽类肉瘤病毒的外膜蛋白(EnvA)包装的RbV形成的病毒颗粒,只能识别在禽类细胞表达的TVA受体。而将TVA受体和表达G糖蛋白的病毒特异性感染某一类神经元,可以实现RbV-EnvA-△G病毒系统对特定神经元的标记和示踪。 5.感染性和毒性(Infectivity and toxicity):即病毒感染细胞的效率和病毒对细胞的毒性。所有细胞都有一个内在防御系统,该系统通过模式识别受体与外来的蛋白质或核酸结合,启动一系列的细胞防御反应,比如:细胞因子表达或细胞凋亡。因此对于理解病毒的作用和潜在的毒性,选择对应的病毒载体尤为重要。理想的病毒应该是高感染性和低毒性,但是两者之间往往难以统一,需要折中处理。神经科学中,AAV、HSV、CAV称为半惰性载体,可以降低细胞的防御能力。而RV、PRV、HSV-H129虽然能快速感染并表达目的基因,但会引起强烈的免疫反应。 6.病毒表达的动态(Expression dynamics):需要知道病毒颗粒将基因组表达到细胞内,基因组什么时候开始表达,什么时候达到峰值,什么时候不能表达。理解病毒表达的动态变化对病毒的选择尤为重要。例如如果需要病毒在局部快速表达,但不需要长期表达,HSV病毒是一个不错的选择。但如果希望病毒在局部长期表达,但不需要快速表达,则AAV病毒较为合适。当然还可以结合其他遗传工具(Cre-ER、tTA等)特异性限制病毒表达的时间窗。
二、病毒工具的选择和使用
利用重组病毒工具,可以对神经科学中的分子、细胞、环路及行为学功能进行深入系统的研究。 1.神经元信号记录和调节:成像的方式观察神经元和调节神经元活动是研究神经功能的关键方法。标记观察和操纵神经元往往需要长时间进行研究,并且对神经元特异性和细胞毒性有一定的要求,因此AAV病毒是一个良好的选择,其优点是表达的持续性,适应范围广和生产方便。将CHR2或DREADD构建到AAV病毒载体结合特定的启动子元件,能特异性调控某一类神经元的活性。而将GCaMP2或者其他指示蛋白构建到AAV病毒载体结合光纤光度法能对神经元的钙信号进行成像。 2.神经环路的操纵:神经元之间的连接性是神经元功能实现的重要基础,目前针对神经元连接性已经开发出一系列的病毒操纵工具,利用不同病毒的特点感染神经元的胞体或者末梢,在神经元内顺轴浆运输或者逆轴浆运输传递,将病毒携带的基因在特定位置的神经元表达,以达到标记环路和操纵环路神经元活性的效果。另外通过病毒编码“条形码”的方式标记细胞,可通过目标脑区中条形码的数量来判断神经连接的强弱。 3.分析细胞中基因功能:利用病毒载体在特定目标脑区使用特定类型的细胞操纵感兴趣的基因,以研究该基因在分子、细胞、环路和行为方面的功能表现目前已成为神经科学领域的主流研究内容。但是用病毒敲除或者过表达基因,造成该基因的急剧减少或增加是人为介导的,且远超真实的生理或病理表达,有可能产生误导性结果。病毒感染细胞后通过高通量RNA测序,以鉴定出该表达基因的全基因组关联的共表达网络和相关的通路富集分析,可以从系统层面理解该分子的功能。 Figure3.通过病毒工具研究中枢系统功能
展望
病毒工具的出现促进了神经科学的研究进展,不同类型的病毒有其独特的优势,也有其存在的局限性。神经科学家对病毒做了很多改造和升级,比如增加病毒感染的特异性、控制病毒表达的时间窗和降低病毒的毒性。未来理想的病毒工具应具有以下特点:高病毒滴度和无限制的负载量、递送方式简单且微创、能够感染所有细胞类型又能靶向感染某一细胞类型,完全不引起内源性免疫反应和表达动力学特征可定可调。未来,病毒工程学的不断进步将提供更高效更特异的病毒,为解密神经科学带来更多的定制化方案。 原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33110222/ 公司相关业务:基因编辑(敲入、敲除、点突变、敲低、过表达、干扰等)、行为学小鼠模型构建、干细胞诱导分化、神经示踪、整包服务等。 官网: www. brainvta. ltd |