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细胞壁不溶性化酶(cell-wall binding acid invertase, B-AI) 试剂盒说明书 分光光度法 50 管/24 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: 蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖 代谢关键酶之一。根据最适 pH,Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。 AI 的最适 pH 为 3~5。AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI(B-AI)两种类型。 B-AI 存在于细胞间隙并结合在细胞壁上,主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解,以维 持库源之间蔗糖的浓度。 测定原理: B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物, 在 510nm 有特征光吸收,在一定范围内 510nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。 自备用品: 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制: 提取液 1:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 提取液 2:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 25mL 试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃ 保存; 试剂三:液体 30mL×1 瓶,4℃保存; 粗酶液提取: 按照组织质量(g):提取液 1 体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液 1),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,弃上清,沉淀中加入 1mL 蒸馏水,充 分震荡混匀,12000g 4℃离心 10min,弃上清,沉淀中加入 1mL 提取液 2 充分混匀,4℃浸 提过夜,12000g 4℃离心 20min,取上清置冰上待测。 测定步骤和加样表: 试剂名称(μL) 测定管 对照管 样本 200 200 试剂一 800 试剂二 800 混匀, 37℃准确水浴 30min 后,95℃水浴 10min(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分 混匀(以保证浓度不变) 试剂三 500 500 混匀,95℃水浴 10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀, 510nm 处,蒸馏 水调零,记录各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘 以相应稀释倍数),ΔA=A 测定-A 对照。 B-AI 活性计算: 标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001;x 为标准品浓度(μg/mL),y 为吸光值。 (1)按蛋白浓度计算: 单位的定义:37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 B-AI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr (2)按鲜重计算: 单位的定义:37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 B-AI 活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =20.8×(ΔA +0.001) ÷W V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。 |