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RT-qPCR 技术讲堂
RT-PCR、qPCR、Real-time PCR、RT-qPCR 你能区分的开吗? 什么是 RT-PCR? RT-PCR 即反转录 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应 (PCR) 的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中,一条 RNA 链被反转录成为互补 DNA (complementary DNA, cDNA),再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。 什么是 qPCR、Real-time-PCR? 其实 Rea-time-PCR 和 qPCR (Quantitative Real-time PCR) 是一码事,都是实时定量 PCR,指的是 PCR 过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。 什么是 RT-qPCR? RT-qPCR 指的是结合了荧光定量技术的反转录 PCR:先从 RNA 反转录 (RT) 得到 cDNA,然后再用 Real-time PCR 进行定量分析 (qPCR)。下面我们将重点针对 RT-qPCR 进行介绍。 RT-qPCR 基本原理和概念 实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR) 是一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化对 PCR 过程进行实时监控,以此实现对初始模板的定量分析。 在实时 PCR 扩增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和 Ct 值。 基线 (baseline):指在 PCR 扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。基线确定应考虑足够的循环数,消除扩增早期的背景,但应排除扩增信号开始超过背景的循环。一般来讲,第 3-15 个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。 阈值 (threshold):一般情况下,PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,实时荧光定量 PCR 反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加,阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。 Ct 值 (Ct value):C 代表 Cycle,t 代表 threshold。简单讲,Ct 值就是 qPCR 中起始模板扩增达到一定产物量 (阈值) 时,所对应的循环数。是一个没有单位的参数,跟初始模板的量呈反比。Ct 值的范围一般为 15-35。Ct 值小于 15,一般为初始模板量过大,扩增在基线期范围内,未达到阈值。CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。理想情况下,扩增效率为 100% 的时候,计算出基因单个拷贝数定量的 Ct 值在 35 左右,若大于 35,理论上模板起始拷贝数小于 1,可认为无意义。 RT-qPCR 步骤 一. RNA 抽提:https://www.biomart.cn/66245/news/2970138.htm |