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单克隆抗体自 1975 年问世以来,在检验医学诊断试剂、蛋白质提纯及肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术等领域得到了广泛的应用,但利用鼠源淋巴细胞杂交瘤制备的单克隆抗体用于人体时,很容易被人类的免疫系统识别,不但产生人抗鼠抗体(HAMA) 使得抗体疗效减弱,还可能引起过敏反应。
基因工程抗体是在深入了解抗体基因结构和功能的的基础上,根据研究者的意图,利用 DNA 重组技术,在基因水平设计生产出新型的抗体。其中全人源抗体具有高亲和力、高特异性以及毒副作用较小的优点,在全球单抗市场中所占的比重越来越大。噬菌体展示技术可用来筛选人源化、多功能化、高亲和力特异性抗体。 噬菌体展示抗体库是目前发展最成熟、应用最为广泛的基因工程抗体筛选技术,通过噬菌体展示技术使基因工程抗体以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白 gpⅢ或 gpⅧ的 N 端,从而将抗体的基因型和表型连接起来,用固相或液相化抗原与抗体库孵育,经「吸附—洗脱—扩增」数个循环使特异性克隆得以富集,因而具有简便、快速和高效的优点。 噬菌体展示技术的优势 1. 方法简便快速、耗时少。从 mRNA 提取到抗体库构建,继而筛选出特异性抗体的阳性克隆仅需几周的时间。 2. 筛选容量大、效率高。噬菌体抗体库中通常含有 106-109 个不同抗原结合特异性的抗体分子克隆,可以对百万乃至亿万个分子进行选择,且每一轮「吸附-洗脱-扩增」可以使抗原特异性较强的克隆得到富集,非常容易从抗体库中筛选到特异性抗体。 3. 易于在基因水平操作,蛋白质表型与基因型统一。可以根据不同目的「随心所欲」地改造抗体结构、进行基因突变,制备各种新型抗体;另外,还可以将噬菌体抗体与一些功能性分子偶联形成免疫毒素、酶标抗体等,进一步拓宽了抗体的应用范围。 4. 易于规模化生产。 噬菌体抗体库的构建 库容和多样性是评价噬菌体抗体文库质量的 2 个重要指标,库容大、多样性高的抗体文库才能方便、快捷地筛选出低抗原性、高亲和性等生物学活性的优质抗体。高质量的抗体文库,是筛选出高亲和力、高特异性抗体的保证。
(1)抗体可变区基因的获得
构建一个噬菌体抗体库,首先必须克隆出 B 细胞内抗体的全套可变区基因。目前,获得可变区基因的途径主要有两种: 1)从基因文库中获取可变区基因,但这一过程相当费时,而且由于 Ig 基因结构的复杂以及大量非功能性假基因的存在,使得从基因文库中筛选出的阳性基因并不一定是可变区基因,还需要将功能性和非功能性重排片段区别开来。 2)用 PCR 法扩增 Ig 的 VH 和 VL 基因,这得益于 1989 年 Orlandi 等「通用引物」的合成,并极大地推动了基因工程抗体的研究。由于它所需模板量少,操作简便、省时,重链、轻链各自的一对引物不需要精确匹配,并常可在引物中加入限制性酶切位点,使扩增基因可直接连入表达载体中 , 所以目前人们构建噬菌体抗体库时,可变区基因的获取多采用这一途径。 (2)载体的构建 噬菌体直接作抗体技术载体的不足之处在于其感染效率较低,复制数和 DNA 稳定性也较低,抗体表达水平不易调控,插入较大片段时,对噬菌体的感染产生不利影响。因此,目前较多采用噬粒来建立抗体库。用于噬粒呈现系统的主要载体有 pHEN1,pComb3,peombs,Psex,pCANTAB5E。噬粒是一类将噬菌体和质粒的某些元件组合在一起的载体,主要构成元件包括大肠杆菌复制子、抗药性基因、噬菌体包装信号基因、原核启动子、操纵子和酶切位点等。 (3)抗体可变区基因的表达 构建的表达载体转染或转化宿主细胞即可表达抗体片段。噬菌体抗体库常用宿主细胞有大肠杆菌 TG1 和大肠杆菌 HB2151。采用不同的方法可表达附着型或分泌型抗体片段 Fab、Fv 和 scFv。在设计载体时,须在抗体基因和 gPⅢ之间插入 1 个琥珀终止密码子,当此密码受到抑制时抗体就显示在噬菌体表面,而密码不受抑制时抗体就分泌表达。因此,当重组噬菌体生长在抑制型大肠杆菌 TG1 上时,抗体基因就与 gPⅢ融合表达于噬菌体表面,用于筛选含有高亲和力抗体的噬菌体。当重组噬菌体生长在非抑制型大肠杆菌 HB2151 时,抗体基因就分泌表达于大肠杆菌的周质腔中,用于制备高亲和力抗体时,这 2 个过程分别模拟了 B 细胞和浆细胞的功能。 |