大家都在搜
我们先来看网络上的一个求助帖:
从上面的求助帖中我们可以总结出几大信息: 1. 血液直接冻存到 -80℃ 再提取是个大问题,没有人能确切回复可行的操作方案。实际上即使我们查找著名的核酸纯化试剂盒公司 QIAGEN 的网站,也找不到从 -80℃ 冻存的血液中提取 RNA 的方法。 2. 血液不加任何试剂直接冻存在 -80℃ 时,RNA 会降解吗?如果会降解,多久会降解完? 3. 回复的建议都是猜测性的,没有做过实际的测试。 众所周知,RNA 容易降解,所以一般提取 RNA 都会使用新鲜的样本,如果新鲜样本不能立即提取 RNA,应立即放到 -80℃ 冻存—从这一点上讲,发帖的求助者也没做错。但关键是血液中的红细胞不含有 RNA,提供 RNA 的主要是白细胞,市面上主要的血液 RNA 提取试剂盒(比如 QIAGEN)用到的原理是将白细胞与其它组分分离(用红细胞裂解液去除红细胞)再提取其中的 RNA。一旦血液经过冷冻就会出现溶血现象,这时所有的细胞都发生破裂,已经无法分离白细胞了,使用这种方法自然也就提不到 RNA。 Simgen 的全血总 RNA 试剂盒,是无需红细胞裂解液分离白细胞,直接从全血中提取 RNA 的,是不是能从冷冻的抗凝血中提取到 RNA 呢?让我们实测一下吧: 实验材料: -80℃ 冷冻 75 天的抗凝全血;预先按 500 µl 血样比 1 ml Buffer L9 的比例加入 Buffer L9 的同一个抗凝全血样本作为对照组(备注:Simgen 全血总 RNA 试剂盒中的 Buffer L9 与抗凝全血预混后可在-20℃ 长期冻存,RNA 不会降解)。 实验试剂: 全血总 RNA 试剂盒(simgen,Cat.No.5201050)、 cDNA 第一链合成试剂盒(simgen,Cat.No.7306025)、 2×SYBR Green PCR Mix(simgen,Cat.No.7106100)、 人 β-actin 引物(Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG /Reverse: CTGGAAGGTGGACAGCGAGG) 实验方法: 1. 分两组进行对比实验,每组各做两管:第一组取 2 个 2 ml 离心管,各加入 500 µl 新鲜全血,编号 1、2;第二组加入 500 µl 新鲜全血后再加入 1 ml Buffer L9,混合均匀,编号 3、4。将两组样本置于 -80℃ 冻存,冻存 75 天。 2. 75 天后取出后置于室温,待血样全部融化后,向 1、2 中加入 1 ml Buffer L9 混合均匀; 3. 13000 rpm 离心 10 分钟; 4. 吸取 700 µl 离心上清转移到装有 500 μl 无水乙醇的 1.5 ml 离心管中,混匀; 5. 分两次将混合液转移到核酸纯化柱中,离心去滤液; 6. 依次用 500 µl Buffer WA 和 700 µl Buffer WBR 各洗涤一次; 7. 用 50 µl RNase-Free Water 洗脱 RNA; 8. 在微量紫外分光光度计上测量 RNA 的浓度; 9. 琼脂糖凝胶电泳; 10.逆转录制备 cDNA; 11.取 5 μl cDNA 模板进行 RT-PCR 检测。 实验结果: 1、在微量紫外分光光度计上用 RNase-Free Water 调零,测量洗脱下来的 RNA,结果如下,
表一
从表一的数据上可以看出两种方法处理的抗凝血经过 75 天的长期保存后均提取出了 RNA,且浓度并无太大差异。 2、在 1% 的琼脂糖凝胶上,加入 8 μl 血液 RNA,电泳 15 min,结果如下,
图一:琼脂糖凝胶电泳图
M:DL 2000 Ladder DNA Marker
1、2:500 μl 冷冻抗凝全血提取的 RNA 3、4:500 μl 抗凝全血加 1 ml Buffer L9 预先混合后提取的 RNA 从图一所示的电泳图中可以看出,四个样本的电泳条带都很清晰。 3、荧光定量 PCRβ-actin 基因检测结果, 图二:RT-PCR 曲线(Delta Rn vs Cycle) 阳性:血液总 RNA(50 ng/μl) 1、2:500 μl 冷冻抗凝全血中提取的 RNA 阴性:无菌超纯水 3、4:500 μl 抗凝全血加 1 ml Buffer L9 预混对按照 从图二可以看出,两组不同处理的冷冻全血中提取的 RNA 经逆转录后获取的 cDNA 在 RT-PCR 检测中几乎与阳性同时起线,且 Ct 值较靠前。 从本次实验可以得出结论:由于 Simgen 全血总 RNA 试剂盒可以从血液中直接分离纯化总 RNA,不需事先分离白细胞,自然也不怕冷冻血液溶血。本次实验测试,一次可以从 500 μl -80℃ 贮存 75 天的冷冻全血中提取到 3 μg 左右的血液总 RNA,且纯度很高,完全满足后续基因检测的需要。 最后我们可以对网络上的求助帖做几条有价值的回复了:
Simgen 实验室
2017.12.02 |