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近日,北京协和医院响应国家卫生健康委号召,作为北京市第一批「新冠病毒」检测试点单位,发布了《新型冠状病毒核酸检测》标准操作流程的培训视频。视频一经发布,受到医疗机构的广泛关注,为其开展「新冠病毒」核酸检测提供了合理规范和有益参考。
《新型冠状病毒核酸检测》标准操作流程里其中至关重要的一步就是如何提取样本里的核酸,视频里也做了非常详细的说明,为了方便大家仔细阅读,我们以文字的形式记录如下。
● 目的与适用范围说明 ●
本流程仅供参考。 (三)样本的核酸提取 A、手工核酸提取操作流程(以凯杰的 52906 柱提法核酸提取试剂盒为例) (1)裂解液配制:在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的普通试剂配制实验室中,准备核酸提取所需的洗液 1(AW1)、洗液 2(AW2)和 carrier RNA。按照要求,分别向洗液 1 和洗液 2 中加入分子生物学级别的 130 ml 和 160 ml 的无水乙醇并及时做好标记;取 310μl 洗脱液(AVE)溶解 310 μg/支的 Carrier RNA。配置好后,通过传递窗进入核酸提取区或由工作人员送入核酸提取专用实验室。 (2)样本裂解:取 560μl AVL 裂解液到 1.5 ml 无菌 EP 管中,加入 5.6μl 配制好的 Carrier RNA,再加入已经灭活的 140μl 样本(例如咽拭子、血浆等),混匀振荡 15 秒,室温静置 10 分钟,充分裂解样本中的核酸。将 EP 管瞬时离心后加入 560μl 无水乙醇,充分混匀 15 秒,再次瞬时离心后备用。吸取 630μl 裂解产物,小心加入至离心柱中,8000rpm(或 6000 g)离心 1 分钟,转移离心柱至新收集管,将剩余 630μl 裂解产物加到离心柱中,重复上一离心操作(若样本体积大于 140μl,则在此步骤重复将 630μl 裂解产物过滤收集在一个离心柱上)。 (3)核酸的洗涤:取 500μl 洗液 1(AW1)至离心柱中,8000rpm(或 6000 g)离心 1 分钟;换新收集管后,取 500μl 洗液 2(AW2)至离心柱中,8000rpm(或 6000 g)离心 1 分钟;换新收集管后,用 14000rpm(或 20000 g)离心 3 分钟,去除洗液 2(AW2);换新收集管后,继续用离心机最大转速(20000 g)离心 1 分钟,充分甩离残留的洗液 2(AW2)。 (4)核酸的洗脱和回收:取一 1.5 ml 无菌 EP 管,将离心柱放入其中,加入洗脱液(AVE)40~60μl,室温静置 1 分钟后,用 8000rpm 离心 1 分钟回收核酸,以备 PCR 检测使用。 B、要点提示 ● 向离心柱中加入裂解产物、洗液时操作要非常小心,尽量将洗头下探到离心柱内部后靠管壁加样,切忌出现溢洒后污染到离心柱的密封圈,这可能会导致乙醇残留,抑制后续 PCR 反应。 ● 从离心机中取出离心柱时应小心操作,避免离心柱下缘被收集管中的滤过残液污染。 ● 加入洗液 2(AW2)后的第二次空管全速离心非常关键,能帮助充分甩离离心柱滤膜中残留的洗液 2 残液,确保洗脱核酸的纯度。 ● 洗脱液加样时需小心操作,确保洗脱液尽可能覆盖全部离心柱滤膜,充分洗脱核酸,提高核酸提取的产量。 ● 手工核酸提取可优选使用检测试剂盒说明书推荐的配套手工提取试剂,也可选用通用手工提取试剂。 Hettich 离心机产品线齐全,从微量管离心机至台式离心机,有众多型号可供客户选择! 例如:IKRO 200/200R 离心机可同时进行 24 位 1.5~2 ml 的 EP 管的离心实验(转子标配生物防护盖),最高转速可达 15000rpm,离心力最高可达 21382 g,而且 200 重量约 11.5 kg,制冷版 200R 重量约 28 kg,轻巧方便,为新型冠状病毒核酸检测提供最给力的帮助! |