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表观遗传学自提出以来,众多关于表观相关的技术日新月异的发展,这些技术也为表观遗传学的发展助力。在众多表观研究中,甲基化无疑是其中最重要的一环,尤其是 DNA 甲基化。
▲胚胎发育中 DNA 甲基化情况
近年来,RNA 甲基化也受到众多科学家的青睐,相关研究报道的文章如雨后春笋般发表。尤其是 2018 年和 2019 年的国自然公布结果看,RNA 的 N - 甲基腺嘌呤(m6A)修饰一篇蓝海。关于 RNA 甲基化修饰中涉及到的调控因子也越来越受到关注。热门关注点要么关注 Writers(METTL3、METTL14 和 WTAP 等),要么关注 Erasers(ALKBH5 和 FTO),要么就是 Readers(YTHDC1、YTHDF1 和 YTHDF3 等)或者干脆放弃研究这些调控因子功能,转而研究与组蛋白甲基化修饰的关联。
▲m6A 的调控机制
但是与 m6A 同宗的 DNA 另一种甲基化修饰 N - 甲基腺嘌呤(6mA)修饰却并未如 m6A 一样势如破竹。或者说在真核生物中研究步伐稍显迟缓。较研究历史来说,DNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(6mA)比 RNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(m6A)更早受到关注,但也仅限于原核生物。究其原因,也许是因为在生物体中的丰度不同造成相关结果。在哺乳动物中,RNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(m6A)的比例为 0.1-0.4%,平均每条 m6A 有 3-5 个 m6A 位点;而对于 DNA,其表达丰度非常低,在哺乳动物中,平均每百万个腺嘌呤中只有不到 10 个 6mA 位点。低频率、低含量的限制造成检测的困难。但是随着检测技术的发展,高灵敏度质谱分析方法成为可能,而高通量测序技术的发展以及低起始量建库测序技术的革新,6mA 的全基因组范围内研究已经不再受到限制。
▲6mA 调控机制 而植物中关于 m6A 的全基因组分布及调控情况研究较少,目前已知的只有拟南芥和水稻的 m6A 分布情况稍有报道。 当然,关于 DNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(6mA)的研究肯定有很多科学家正在研究或者即将要研究,随着其在基因组的分布情况及调控因子的发现,关于真核生物中 DNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(6mA)的调控机制将会进一步揭示,而其与据目前研究说是在真核生物中作为 DNA 的 5 - 甲基胞嘧啶甲基化修饰(5mC)的一种补充,其在真核生物的功能将会被进一步为人类所了解,届时,DNA 甲基化研究也将会大迈步向前跨进。 关于 DNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(6mA)和 RNA 的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰(m6A)研究方法大致相同,主要分三步: 第一步:材料的制备
材料的制备可以是通过基因敲除(敲低)或者是不同生长组织(不同细胞、不同组织部位)或者不同生长条件等;
▲不同材料的选取
6mA 或 m6A 含量的测定方法有 LC-MS/MS 或 Dot blot,其检测流程见下图。
▲LC-MS/MS 和 Dot Blot 流程图 第三步:高通量测序技术 在高通量测序技术中,常规主要是 6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)和 SMRT(Single-molecule real-time sequencing)。 m6A-IP-seq (Methylated RNA immunoprecipitation sequencing)和 6mA-IP-seq(DNA N6-methyladenine Immunoprecipitation Sequencing)都是利用特异性抗体富集 6mA(m6A)片段,扩增后进行高通量测序及甲基化分析,以较小的数据量,快速地绘制全基因组 DNA(RNA)甲基化水平的图谱。而 SMRT(Single-molecule real-time sequencing)也叫作单分子实时测序技术,采用的是对 DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法,聚合酶合成每一个碱基,都有一个时间段,而当模板碱基带有修饰时,聚合酶会慢下来,使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值结果大于 1,由此就可以推断这个位置有修饰。 两种不同的方法各有优缺点,6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)检测灵敏度高,能捕获到全基因组的甲基化修饰位点,但是它是非单碱基分布。而 SMRT(Single-molecule real-time sequencing)能做到单碱基分布,属于三代测序范畴,但是其准备性因为读长较长原因而有所下降。总体来说,两种方法都可以检测全基因组范围内的 N6 - 腺嘌呤甲基化修饰,要怎么抉择就看个人选择了。下图中展示了两种不同的测序方法的比较: ▲SMRT 及 6mA-IP-seq(两张不同厂家抗体 SYSY 和 Abcam)分析的 6mA 的 peak 重合情况 ▲SMRT 测序及 6mA-IP-seq(两张不同厂家抗体 SYSY 和 Abcam)分析的 6mA 的保守 motif 情况 值得注意的是,6mA 的定量需要严格的无菌样品制备,因为它有被原核 DNA 污染的可能性,而在原核 DNA 中,6mA 是普遍存在的,且数量丰富。 |