一.相关定义 抗体:机体在抗原物质刺激下,由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文缩写为Ig. 抗原:指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合,发生免疫效应(特异性反应)的物质。简单的说抗原就是一种特定的外来物质。 抗原表位:结构已经确定了的抗原决定簇(即能与特异性抗体结合的区域)。 抗体的效价:指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间,以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
二.抗原的偶联(半抗原的偶联)因为半抗原一般只有反应原性,没有免疫原性,注入机体后易被机体所吸收。一般而言,半抗原连接一定的蛋白载体(BSA, KLH, OVA, HAS等等)就有比较好的免疫原性了,不同的物质有不同的偶联方法。这个可以查看相关资料。
三.动物的免疫 1.一般用年轻健康的新西兰大白兔作为免疫的对象,大小为4到5斤。 2.兔的免疫剂量为200ug-1mg/次,以后每次适当减少,加强免疫的量为首次的1/5-2/5. 3.初次免疫一般将抗原与佛式完全佐剂(由羊毛脂,石蜡油,卡介苗组成,卡介苗起免疫应答的作用。)等体积混合,后续免疫用佛式不完全佐剂等体积混合,一般采取皮下注射免疫周期一般为70天。具体免疫时间如下:
免疫次数 |
免疫时间 |
初次免疫 |
第1天 |
第二次免疫 |
第20天 |
第三次免疫 |
第40天 |
第四次免疫 |
第60天 |
4.最后一次免疫完成10天以后,就可以进行终放了。其中在第三次免疫完成以后的第10天即在第50天的时候静脉取血检测抗体的效价。 四.抗体效价的检测(一般用ELISA间接法进行检测) 1)2个参照:阴性参照为预取血血清,均以1抗起始浓度稀释;阳性参照为以前阳性血清或者细胞上清 2)于96空板中每孔适量的抗原,边沿孔应尽量避免使用,会降低细光值,影响结果。于4℃过夜,紧急情况也可以37℃孵育2小时。 3)倒掉抗原,每孔加入200ul的封闭液,4℃过夜或者37℃孵育2小时。 4)倒去封闭液,在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,尽量风干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。 5)取包好的96孔板,第一孔加入阴性参照液50ul,第二孔加入阳性参照液50ul,第三孔加入稀释的抗体(1:500=抗体:封闭稀释液),后面的第四孔到第12孔加入50ul的封闭稀释液,然后取50ul稀释的抗体进行梯度稀释,第12孔取出50ul的液体,保证每孔液体为50ul。再于37℃孵育1 小时。 6)倒掉液体,用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的HRP标记的2抗(1:2000),于37℃孵育45分钟。 7)倒掉液体,有洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的TMB底物(A+B等体积配置,现配现用)温室孵育5—20分钟(根据颜色的改变速度)。 8)每孔加入100ul的终止液(0.M草酸),在酶标仪上读取450nm的吸光度。 五.抗体的纯化。(一般用亲和纯化,这种方法得到的抗体的纯度高一些。) (1) 亲和柱的制备 1)称取0.3mg溴化QING活化的琼脂糖凝胶加入1mmol/L的盐酸中,4`C过夜使其充分溶涨,可获得1ml溶涨胶。 2)将凝胶转移入纯化柱中,用约30ml 1mmol/L的盐酸洗介质3次。 3)用偶联缓冲液洗介质一次,因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解,所以此步骤最好在几分钟内完成。 4)将溶解在5ml偶联缓冲液中的10-60nmol的配体加入凝胶中,如需测定结合效率一定要取少量陪体溶液待测。 5)温室下轻轻混合摇动2小时,或4`C过夜,如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。 6)用30ml的偶联缓冲液洗介质一次。 7)加入15ml阻断缓冲液温室孵育2小时或4`C过夜。 8)依次用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液洗介质一次。重复4次步骤8。 9)重复4次步骤8。 10)配体固相化完成,可用于纯化。 11)若不立即使用,用20%的乙醇封存。 (2)抗体的纯化 1)原血清用PBS等体积稀释,混匀1min,5000-10000r/min,4-20离心15分钟,取上清,并留样送检。 2)用层析仪或手工,10倍体积的PBS 2-4ml/min流速清洗平衡柱子。 3)稀释离心完的上清样品,0.5-1ml/min流速上样。 4)上样完后,用15倍体积的PBS2-4ml/min流速清洗平衡柱子,洗去柱子上残留的杂蛋白。 5)用5-10倍体积的Anitibody Elute Buffer C 洗脱结合在亲和柱子上的抗体,分管收集,没管收集1ml并预先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D调PH至中性(PH7-7.5),如果有层析仪也可以根据层析仪紫外吸收峰检测收集。 6)洗脱完毕后,柱子用5倍体积的PBS 2-4mi/min流速清洗平衡。 7)用20%的酒精封存柱子,4`C保存。 (3)抗体的浓缩 1)一般收集浓度较高的几管洗脱液,无须浓缩,若弄多实在太低(小于0.5mg/ml),则将收集的馏分加和起来。 2)转移入15ml 的超滤管,3500r/min离心20分钟左右(根据要浓缩的体积摸索离心时间),将浓缩好的抗体小心的用移液器取出来。 3)取700ul 浓缩的抗体检测280nm的吸光度,读数不要超过2,用吸光度读数除以1.35,即为抗体的大致浓度。抗体的浓度也可以用(OD280nm-0.35xOD495nm)1.4这个公式计算。浓缩的程度:使抗体的浓度在0.5-1mg/ml之间最好。最后通过浓度x体积计算抗体的总量。 (4)抗体的保存 抗体中添加40-50%甘油,可以短时间存放于4℃,如需以后使用,一般500ul/管冻存于-20℃或者更低温度的冰箱中。 (5)抗体纯度的鉴定 一般而言,我们在将抗体纯化以后,如果想知道抗体的纯度和浓度究竟怎么样,就需要走个SDS-PAGE电泳。电泳的方法在网上到处都是,在此就不多说了。 |