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三位「火枪手」
2019-01-09 08:59   来源: 江苏吉锐生物技术有限公司  点击次数: 关键词: 温度 IPTG浓度 诱导时长
胰岛素对于糖尿病患者来说,那就是救命稻草。但 20 世纪初期,胰岛素往往要靠从牛、猪等大牲畜的胰腺中提取,导致胰岛素产量远远不能满足需要,人们急需另辟蹊径。

直到基因工程技术慢慢进入人们的视野,科学家利用带有人胰岛素基因的基因工程菌,进行大量增殖,生产出大量的人胰岛素,大肠杆菌成为生产胰岛素的「活工厂」。今天小编就带着您了解下原核表达过程中主要的影响因素,其中三位「火枪手」是今天的主角。

第一位「火枪手」是温度,温度对发酵的影响及其调节控制是影响有机体生长繁殖最重要的因素之一,因为绝大部分生物化学的酶促反应与温度变化有关。温度对发酵的影响是多方面且错综复杂的,主要表现在对细胞生长、产物合成、发酵液的物理性质和生物合成方向等方面。

 

第二位「火枪手」是 IPTG 浓度(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷),E.coli 的乳糖操纵子(元)含 Z、Y 及 A 三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列 O、一个启动序列 P 及一个调节基因 I。I 基因编码一种阻遏蛋白,后者与 O 序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列 P 上游还有一个分解(代谢)物基因激 活蛋白(CAP)结合位点。由 P 序列、O 序列和 CAP 结合位点共同构成 lac 操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。

在没有乳糖存在时,lac 操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I 序列在 PI 启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合,阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合,抑制转录启动。当有乳糖存在时,lac 操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经 β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与异乳糖相同,是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

 

第三位「火枪手」是诱导时长,顾名思义就是给大肠杆菌表达外源蛋白的时间。一般来说,并非是时间越长越好。外源蛋白对大肠杆菌来说,有一定的毒负性,而且如果目的蛋白是可溶性蛋白,过长的诱导时间,会导致包涵体的比例上升。

总的来说,对于大肠杆菌发酵工艺中试及以下规模,都可以从温度、IPTG浓度和诱导时长这三个角度摸索,最终得到适合自己的最佳条件。

原核表达优缺点也十分明显,成本低廉是原核最大的优势,缺点也十分明显,1)组装问题、2)易形成包涵体、3)纯化复杂(宿主蛋白种类繁多)


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图片来源:吉锐

 

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