外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外的一种直径约 30 ~ 150 nm 的膜性囊泡。几乎所有的细胞都会产生外泌体,被分泌出的外泌体会进入各种体液,通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。
相关设备: 1,匀浆器 2,网状过滤器 40-μm 3,注射器过滤器 0.2μm 4,高速离心机 5,涡旋振荡器 操作步骤: 一、脑浆液化处理: 1,将新鲜或先前冷冻的小鼠半脑切开,加入 Hibernate E 溶液 (3 mL /半脑); 2,加入 20 单位/ mL 的木瓜蛋白酶,在 37℃ 水浴 15 分钟; 3,加入等体积预冷 Hibernate E 后,轻轻匀浆;匀浆过程中在冰上进行; 4,脑匀浆通过 40-μm 网状过滤器过滤; 5,滤液再通过 0.2-μm 过滤器过滤,收集滤液;
二、液化脑浆预处理; 1,离心去碎片:将液化脑浆液转移至离心管中,于 4℃ 以 3000 g 离心 10 min,去除滤液中的碎片;离心后上清液转移到新的离心管中; 2,离心去杂质:转移后的上清液于 4℃ 以 10000 g 离心 20 min,去除样品中杂质,将离心后的上清液转移至新的离心管中;
三、脑浆外泌体的提取; 通过 Umibio Exosome Isolation Kit 提取外泌体颗粒。 1,上清液预处理:在去除杂质的离心上清液中加入 Exosomoe Concentration Solution(ECS 试剂),具体的加入剂量如下:
注:其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算
3,沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000 g 离心 60 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;(注:尽可能吸净上清液) 4,外泌体重悬:取 100μL 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物,待其均匀悬浮在 PBS 中后,将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中; 5,收获外泌体颗粒:将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12000 g 离心 2 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。(注:若离心沉淀物肉眼可见,再离心一次) 6, 纯化外泌体:将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosomoe Purafication Filter(EPF 柱)上室中,于 4℃ 以 3000 g 离心 10 min,离心后收集 EPF 柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒; 7,外泌体的保存:纯化后的外泌体以保存于-80℃ 低温冰箱中,以备后继实验使用。
参考文献: 1, J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43108-15. 2,J Extracell Vesicles. 2017 Jul 26;6(1):1348885. |