为抵御各种各样的病原体,人类或哺乳动物的适应性免疫系统拥有大量的 T 细胞受体 (TCRs) 和 B 细胞受体 (BCRs),也被称为免疫组库。高通量测序(NGS)技术可对 T 或 B 细胞克隆进行深入分析,有效评估 TCR 或 BCR 互补决定区域 (CDR3) 的多样性,并评估克隆类型的构成,使 T 或 B 细胞检测达到很高的精细度。免疫组库 NGS 检测为评估健康或疾病状态下的机体适应性免疫系统提供了技术支持。
目前,现有免疫组库技术主要分为两类: 1. 基于多重 PCR 的文库构建方案:以 DNA 为模板,针对可变区(CDR3)设计多对引物,扩增出 CDR3 区段,再进行文库构建并测序; 2. 基于 5'RACE 的文库构建方案:以 mRNA 为模板,在恒定区设计引物逆转录扩出 TCR 或 BCR 的全长序列,经过两轮 PCR 富集这一目的序列,再进行文库构建并测序。 尽管 NGS 测序技术可快速便捷地对免疫组库进行全景式扫描,但现有方法仍存在明显的不足之处。如基于多重 PCR 的文库构建方案同时进行几十种引物的扩增,体系异常复杂;多重引物设计需已知参考序列,不能充分捕捉到人类等位基因突变序列;多种引物扩增效率可能存在偏倚,难以等效扩增;与使用 mRNA 构建文库相比,DNA 所需的 PCR 反应体系较大,样本要求较高。这些不足可能会导致假阳性增加和扩增偏倚,从而对数据结果的准确性造成潜在影响。 为改进上述免疫组库测序方法,华银健康对已有的 5'RACE 文库构建技术进行了升级,推出了全新的免疫组库测序技术服务。 技术升级一: 基于 5'RACE 原理,并在原始模板扩增前引入 UMI(Unique Molecular Indices,分子条形码)进行文库构建。在恒定区单引物逆转录扩增出 CDR 区域全长序列的同时,引入 UMI 序列,可对后续 PCR 反应或测序过程中引入的错误进行有效纠正,提高准确率。 技术升级二: 在逆转录环节,设计针对微量样品(低至 100 个细胞)的实验流程:即通过 oligo dT 磁珠捕获 mRNA,以磁珠上的 oligo dT 为逆转录引物合成 cDNA,并纯化回收 cDNA,较常规方法可大大提高效率,保证了人或小鼠来源的微量样本的实验成功率。 全新免疫组库测序技术服务亮点 1. 可满足微量样本建库的实验要求(最低可至 100 个细胞),兼容人和小鼠样本。 微量 RNA 起始建库流程图 2. 低 RNA 起始量的样本也能快速达到测序饱和期,相同 RNA 起始量下的样本其相关度较高。
同一样本 RNA 起始量不同时到达测序饱和期数据统计曲线图 同一样本 RNA 起始量相同时样本间的相关性图 (A1/A2/A3 为起始 RNA 量为 1600ng; B1/B2/B3 为起始量为 400ng; C1/C2/C3 为起始量为 50ng)
经过 UMI 算法校正后的部分测试数据统计表 4. 对测序下机数据进行多维度分析,给出最全面的数据结果报告,并可定制个性化分析服务。
近年来,基于免疫组库多样性变化特点的生物标志物发现、肿瘤等疾病疗效预测、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要进展。免疫组库更是被称为生物标记物的「金矿」。随着免疫组库检测研究的不断发展和成熟,越来越多的测序技术和方法被巧妙整合,各测序技术也在不断升级优化,在解决研究难题的同时,拓宽了传统肿瘤学、免疫学等的研究视野,也为临床疾病诊断提供了新参考。 参考文献: 1.Abbas A K, et al. Cellular & Molecular Immunology 6e[J]. 2.Hou X L, et al. Current status and recent advances of next generation sequencing techniques in immunological repertoire[J]. Genes & Immunity, 2016, 17(3):153. 3.Lefranc, et al. "IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®." Nucleic acids research 37.suppl_1 (2008): D1006-D1012. 4.Chunlin Wang, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. PNAS, 2010, vol. 107:1518–1523. 5.Jennifer Benichou, et al. Rep-Seq: uncovering the immunological repertoire through next-generation sequencing. Immunology, 2011, 135: 183–191. 6.Jeroen W J van Heijst, et al. Quantitative assessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell transplantation. Nature Medicine, 2013,VOL.19: 372-379. 7.Miran Jang, et al. Characterization of T cell repertoire of blood,tumor, and ascites in ovarian cancer patients using next generation sequencing. OncoImmunology, 2015, Vol.4:e1030561-1-10. 8.Evaggelia Liaskou, et al. High-throughput T-cell receptor sequencing across chronic liver diseases reveals distinct disease-associated repertoires. Hepatology, 2015,1-10. 9.Bates S T, et al. Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J]. The ISME journal, 2013,7(3): 652-659. |