hello~大家好,又见面啦~
我是丰晖生物的分子技术支持:美露!
相信屏幕前的你,可能被 shRNA 干扰实验困扰了无数个日日夜夜...... 亦或是屡屡想尝试,却次次与之失之交臂...... ......被困扰的你是跪在哪一步了呢? ......而止步于起点的你又是因为什么呢? 欢迎收看本期的 走近科学节目! 文章!
今天写作这篇文章的目的呢,正是为帮助做实验的你缕清思路。让在干扰实验门口「探头」的你,系统的了解整个流程,从而让入门不再只是想象。
下面我要开始放大招了:
(一)shRNA 干扰机制&shRNA 设计
shRNA(short/ small hairpin RNA)干扰机制图解
shRNA 组成:
shRNA 包括两个短的反向互补序列,中间由茎环(loop)序列分隔,组成发夹结构,随后连上 5~6 个 T(转录终止信号)
shRNA 设计:
1. 直接用软件设计:
BLOCK-iT™ RNAi
Designer: http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=5285499614803467247
Gene Link shRNA Design Guidelines: http://www.genelink.com/sirna/shRNAi.asp
siDirect version 2.0: http://sidirect2.rnai.jp/
CRISPR DESIGN: http://crispr.mit.edu/
CRISPRfinder program online: http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/
2. 手动设计,原则:
A. 首先靶位点选择应该避开基因的非编码区;
B. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T,这可能导致 shRNA 转录的提前终止;
C. Stratagene 发现 29 个寡核苷酸抑制目的基因表达的效率比 23 个寡核苷酸的高;
D. 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C,使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生;
E. shRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头,必须在紧连正义链的上游加一个 G;
F. shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央,比较了众多不同长度和序列的茎环,5'TTCAAGAGA3' 序列最为有效;
G. 5~6 个 T 必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶III终止转录;
shRNA 设计好并合成之后,通过同源重组或者是酶切连接的方法进行干扰载体构建,构建成功后大量抽提质粒(去内毒素且 OD260/OD280 最好在 1.8 左右),以备转染。
(二)转染&WB/QPCR
干扰载体转染(脂质体介导法)
工艺流程 (可以点开保存大图↓)
收集细胞,分别提取总蛋白(用于 WB 检测蛋白水平)和总 RNA(逆转录成 cDNA 用于 QPCR 检测 RNA 水平)
WB工艺流程
QPCR检测工艺流程
好啦!今天的 shRNA 干扰实验的文章就到这里啦~
对文中的实验还有疑问的 可以加我的 QQ:1179810277 任何有关于分子方面的技术需要咨询的,也可以加 QQ! 我是丰晖生物的分子技术支持:美露 我们下期再见!
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