无标记分析DSC 的重要优势是基于热量进行测量,因此可对天然生物分子进行特征分析。另外,由于该方法无需光谱读数,也就意味着样品不一定要透光。并且,DSC 特征分析不仅限于转变温度(Tm),还可以提供与生物分子折叠、去折叠机制有关的热力学数据。 通常,很难单独解释溶液中生物大分子的热力学问题,测量值也通常是分子基团之间相互作用的净作用,以及相同分子基团与溶剂的相互作用。因此,稳定生物体系的能量就是众多有利的相互作用和不利的相互作用之间的差值。很多研究者受此启发,从而发展了 DSC 测量,使该问题变得非常明了。一种认真、有序的方法带来新的生机,逐渐解开相互作用的复杂性。除了可测量与稳定大分子的作用力变化有关的热力学整体,以及无需任何光学元件,DSC 还有其他诸多用途。DSC 可测量与大分子质子化变化有关的简单作用是如何影响热力学和稳定性。该方法可扩展用于任何非共价键配体,成为监测键合作用的一种通用方法。在不利条件下,该方法可用于测量键合常数。本文将讨论 DSC 测量的热力学背景,以及在单独蛋白质和与配体相互作用中稳定性研究中的应用。该技术同样适用于其他生物大分子,如核酸、脂类等。 基本平衡热力学 当外界温度升高超过某一生理相关范围,蛋白质就会发生转变,从有结构的、天然的、有生物活性的构象(N)转变为无结构的、变性的、失去活性的构象(D)。与蛋白质相似,很多其他生物大分子(DNA、脂类等)和一般的有机多聚物都有这样的转变。如果跟踪记录蛋白质的这种构象转变信号,就可得到下图 S 型轨迹。 图 1 由 100 个氨基酸组成的蛋白质变性的典型的 S 型转变。300k 以下,主要为天然蛋白质,340k 以上为变性蛋白质。温度介于两者之间时,每种状态的蛋白质含量分别用黑色和红色箭头长度表示。 当蛋白质的结构按此方式熔解(Melting)时,分子的共价键合性质并无变化。受影响只是非共价相互作用,通常再次冷却蛋白质后,这种相互作用将自动形成,又变回活性天然。因此 N 和 D 随温度变量处于可逆平衡状态。 从图 1 可见,随着温度升高,N 和 D 比例发生变化,平衡向 D 移动。在任何一个温度下都有一个平衡状态,平衡常数(Keq)仅反映 N 和 D 的相对浓度。按对数计算,该平衡常数可用吉布斯自由能 (ΔG) 表示: R 为气体常数,T 为开尔文温度。D 和 N 浓度相等时的温度定义为转变中点或熔解温度 Tm。在该温度下,Keq 等于 1,ΔG 等于 0.对任何蛋白质而言,Tm 都是一个重要的参数,因为该值表示了蛋白质的热稳定性。在 Tm 以下,天然蛋白质浓度高于变性蛋白质,而在此温度以上,变性蛋白质更多。 蛋白质表现出熔解行为的原因是因为其天然结构由许多与温度相关的相互作用来稳定。由焓(ΔH)稳定要求涉及成键、结构和降低内能的相互作用,而由熵(ΔS)稳定反映的是无序的相互作用和增加相同能量下系统组成的方式。它们与ΔG 的关系如以下等式: 联合等式 3 和 4,重新排列得到范霍夫方程 5,通过记录平衡常数与温度的变化,可获得热变性焓和熵的简单线性关系(lnKeq vs 1/T): 图 1 中的数据可用于计算转变范围内各温度的 Keq.由此计算的焓称为范霍夫焓变,取决于 DSC 曲线轨迹形状。因此不是直接测量反应热量。 采用量热仪测定直接测量热力学 顾名思义,量热法,来自拉丁语卡路里,表示热量以及热量仪,是一种直接计算蛋白质变性焓的方法。超灵敏量热仪,如 MicroCal™ VP-CapDSC 适用于精确测量 mg 级物质的焓变。这些设备使用简便、精确、可靠,使这种热量测量成为任何生物物理实验室的常规测量方法。仪器可以通过升温扫描和降温扫描过程中测量蛋白质溶液样品的热熔(Cp, heat capacity)。简单而言,热熔 Cp 表示升高样品温度,一般是 1K 时所需要的能量。根据克希霍夫定律 (Kirchoff's law) 与焓有关: 由于在扫描过程中,仪器测量的是相对于认真匹配的充满溶剂的参比池,样品池中蛋白质所吸收的多余(差示)热容量,因此这类设备被称为差示扫描量热仪。 DSC 测定结果与图 1 一样,只是记录的信号是蛋白质变性过程中的热熔变化。蛋白质的构象转变过程如图 2 所示。 图 2 采用 MicroCal VP- CapDSC 在 20 μM (0.25 mg/ml)、60 K/h 条件下测量的含 118 个氨基酸的蛋白质—芽孢杆菌 RNA 酶变性的 DSC 数据。以红线(上图)表示缓冲溶液记录的对照基线。下图是扣除缓冲溶液后的数据。 从等式 6 可清楚看到,要获得焓变值,就需要对热熔增量进行积分。但在此积分之前,必须扣除由只含有溶剂的试样池和参比池记录的对照基线。鉴于硬件技术原因,样品池和参比池之间的热熔差无法显示为零(红色实线,图 2 上图)。除去基线后,转变峰两侧的线性区域分别代表天然状态和变性状态的蛋白质热熔,外推至转变峰内,通过转变过程与之相整合。这是通过软件途径来实现的。最后,对得到的峰下面积积分后获得样品池中蛋白质变性 DSC 所需要的多余能量。鉴于蛋白质溶液浓度和量热仪的测量体积均为已知,该能量值可转换为ΔH,单位为卡路里或焦耳/mol 蛋白质。一般采用ΔHcal 来表示直接测量的热焓。 MicroCal VP-CapDSC 是一种非常灵敏的设备,可测量稀释溶液中与蛋白质变性有关的热熔的微小变化。溶剂的热熔超过蛋白质多个数量级。因此,为实现最精确、可靠的测量,必须通过确保蛋白质样品和参比溶液的溶剂在组成上严格匹配,从而消除背景热容量。合适的方法包括透析或色谱法,采用最后的透析液或色谱柱洗脱液作为参比溶液。 两状态体系和非两状态体系 如以上所讨论,与发生变性的蛋白质的任何其他特性一样,图 2 中的数据也可采用相同方法进行分析。从而得到 Tm 和依赖于模型的范霍夫焓变;此处采用ΔHvH 以便与ΔHcal 相区别。比较这两种焓变的测量方法,均从相同的实验中获得,为蛋白质变性的方式提供了有力的检测方法。ΔHvH 是指平衡状态下每 mol 协同单位的能量,而ΔHcal 是指每 mol 蛋白质的能量。若这些能量相等,则蛋白质和协同单位相同,或可视为具有相等的分子量,因此可判断两种状态占平衡时的比例。 在其他情况下,ΔHvH 小于ΔHcal,表明平衡态各物质的平均分子量小于蛋白质的分子量,因此,变性过程中纳入中间产物(I)可能会更恰当: 在某些极端情况下,中间体会出现在变性过程中,例如当蛋白质有不同热稳定性的独立折叠区域时,可能会看到两个不同的转变。此处每个转变的ΔHvH 就反映了每个区域的分子量,而基于整个蛋白质分子量的ΔHcal 则反映了系统变性的总能量,也就是两个转变下的总面积。 还有ΔHvH 大于ΔHcal 的情况,表明平衡态各物质的粒径或分子量大于蛋白质。 在此情况下,蛋白质形成二聚体、四聚体、或更高级的聚合物,理论上至少可采用ΔHvH 与ΔHcal 的比值来表示这种数量(n)关系: 与等式 7 不同,因为只包含 N 和 D,所以仍然为一个双状态平衡。ΔHvH 与ΔHcal 的比值的差异表明,在计算中每 mol 的浓度是基于亚单元而非寡聚蛋白质。 同时也提出一个重点,也就是 ΔHcal 的值完全取决于样品浓度。浓度的任何误差都会直接影响焓的估算。包括通常采用的吸收光谱法物理测量浓度产生的误差、蛋白质摩尔消光系数的误差以及纯度低于 100% 的物质(增大吸光度但 Tm 值不同的杂质蛋白质在 DSC 上不会显示)或天然物质未 100% 折叠(增大吸光度但已经展开的变性蛋白质)所导致的误差。因此,在解释ΔHvH 与 ΔHcal 的比值的微小差异时,必须引起注意。 在 DSC 中,样品纯度和浓度精确定量是实验设计和数据分析最重要的部分。 若ΔHvH 与ΔHcal 的比值表示为寡聚变性过程(Eq8),简单地通过核对 DSC 测量的浓度依赖性便可证实。由于平衡涉及浓度变化,也就是单体形态,单体浓度将通过质量作用或勒夏特列原理影响平衡位置。因此,正如实践所知,增大浓度将增大寡聚系统的热稳定性(1,2)。 ΔH 若样品的可利用性允许,即使ΔHvH 与ΔHcal 的比值接近 1,核对 DSC 测量中样品浓度依赖性是机制的一种重要测试,并且永远值得这样做。 不可逆和非平衡变性 完成 DSC 测量后,对相同样品再次进行扫描是一个简单且信息量丰富的实验。若再此扫描过程中出现一个相同的吸热峰,则可判断在平衡状态下天然状态和变性状态之间的相互作用可以完全重复。然而,在大多数情况下,再次扫描蛋白质并无转变过程或数量级降低的焓变。表明在变性机制中存在不可逆的一步: 在这种单分子(U)过程中,如脱酰胺作用、脯氨酸异构化等可导致不可逆的改变,和阻止再次重叠。通常可通过扫描温度仅高于转变范围,而不是达到 DSC 的最高温度,可以提高可重复性,因为不可逆步骤有一个动态因素(速率)。该速率极可能在较高温度下更快。因此超过的温度越高,变性需要的时间就越长,不可逆步骤发生越多。 变性状态的缔合或聚合可能也导致不可逆步骤: 采用初始扫描参数的浓度依赖性可证明。 当样品浓度较高时,D 的浓度将增大,从而不可逆步骤加速,导致蛋白质的 Tm 较低。在大量和快速聚合时,甚至还可能出现扭曲和截断蛋白变性的放热聚集现象,并在转变区域上观察到非典型的噪音数据,如下: 图 3 聚合蛋白质变性的原始 DSC 数据(红色)。聚合差不多完全消除时,在不同条件下缓冲液基线(绿色)和相同蛋白质(蓝色)数据的比较。
热量测定不是一种全能的技术,通常是 DSC 发现聚合问题,这些问题在相同试样浓度采用基于光谱的热变性试验中不常见。无论不可逆性如何,检验试样浓度和 DSC 测量的扫描速率依赖性都可获得更多信息。实际上,在某些情况下,这些信息可用于从初始平衡状态下计算有用的参数,甚至估算不可逆比率(3,4)。
核对 DSC 测量中扫描速率依赖性是机制的一种重要测试,并且永远值得这样做。即使在最简单的单分子平衡中(Eq1)也必须证实 N 和 D 的平衡浓度反映了在此条件下系统的稳定性。这些浓度的变化速率等于平衡时向前(去折叠)和向后(折叠)反应总和。因此,若温度上升快于系统变化,DSC 吸热峰的位置和形状就会被扭曲。将导致 Tm 值有误,ΔHvH 与ΔHcal 的比值不恰当。作为经验法则,对多数蛋白质而言,60 K/h 是一个不错的起点。
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