一、培养板接种和换液相关
1、6孔板接种和换液
（1）问：我的细胞传代很正常，但一种到六孔板里（不管加药和对照），总有两三个孔（随机）细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗？到底是啥原因呢？请各位指点
答：可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15 min先。
另外，跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。
或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，你再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下
（2）问：最近几天，我用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事？
答：你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。
你的培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。
我也经常碰到，我想可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。
不知楼主所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率！
2、24孔板接种
（1）问：我把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞，我也不知道是什么原因，请各位高手仁兄给把把脉，先谢过！
答：是中央长不满，还是中央有和边缘相同密度的细胞，但是大部分都是死细胞？如果是前者，也许不是技术问题，而是物理问题了。
我是选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，必要的步骤吗？另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关？
我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面（就像量筒的液体凹面一样），中央的细胞正好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。
估计你的培养液里可能有贵重的“银子”（因子）啊，想少用点吧，结果就…… ：）
另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。
个人经验认为这是物理问题:24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.
至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果.
在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题，一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡，后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干，我会一个一个空来吸取，最多一次不超过3孔，然后马上加入液体，同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉，这样基本上会避免细胞死亡。
同时你所说的细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因：
1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。
2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。
（2）我的细胞在接种在24孔板上时，孔的 周围细胞密集，中间细胞稀少，我试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀？
周围细胞密集，中间细胞稀少
这种情况一般是种板时培养液过少，液面总是呈一凹面，如果液面过低，孔中间就基本上没什么细胞，所以种板时一定不能吝啬培养液，待贴壁后可以用比较少量的培养液处理。
周围细胞稀少，中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动，特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但我个人认为，将细胞加入孔后，用枪或移液器充分吹打混匀后就不用，也不能再晃动，甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中。
当然，无论是哪种情况，首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的，即种板时的细胞悬液一定要混匀。
细胞分布均匀与否有一点很关键，即每种细胞是有个体差异的，别人的细胞操作不一定适合于你.所以要靠自己摸索，且找出专属于自己细胞的一套规律，就我个人而言，有如下经验：
1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。
2.按资料记载，24孔板的液体量为1ml，个人也觉得1ml的量足矣。
3.接种时，要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头，这样做对细胞均匀分布有一定效果。
4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境，个人认为没有必要在室温放置一段时间。
5.根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以我考虑到，你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少？
另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布，我个人觉得有一定的效果，不知这次我解释清楚没有。
3、96孔板细胞接种换液和收集细胞
（1）问：最近我用96孔培养板培养肿瘤细胞，结果细胞长得不是很理想，不是长得不均匀，就是每个孔细胞生长速度不一样。另外，镜下观察细胞轮廓很不清晰，怎么调焦距效果都不好。（板子是刚拆封的。）不知道怎么回事？
答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-5*10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells.
首先你要尽可能把消化细胞消化成单个细胞（不要成团），反复吹打，掌握好时间（不同的细胞要摸索的），种细胞时要均匀的吸取，清清的吹打一遍再吸取细胞，这样也许会解决您的问题。我以前也是出现这样问题。后来就很好了。
种到96孔板的细胞一定要消化成单个细胞，建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。
我一般在铺板时都是用八排枪加样的，感觉效果还不错。首先如楼上所说要把细胞消化的恰到好处，背着光看瓶底细胞都下来后再对着瓶壁吹打几次即可。然后将细胞悬液转移到加样槽中，在加样过程中，要不停的轻轻晃动加样槽，且在每次吸样前都吹打几次，以防细胞不是均匀的分散在培养基中，造成加样不均。加样时使枪头贴着孔壁缓慢加入，使液体自然流满即可。都加完后平稳拿到镜下观察铺的很漂亮的。听别人说铺完后在96孔板的四个角轻轻磕几下，但我试过，这样效果反倒不好！
我觉得你的问题可能是消化的不好，我的经验希望能有帮助：
1、对细胞的选择要注意，要选择状态好的细胞，密度要选分布瓶底80％为宜；
2、消化时，不要忘了用PBS（或纯的不含血清的培养基）洗一遍，加0.25％的胰酶1ml消化2-3分钟（不同的细胞有差别，你要摸索），还要不时的活动，让胰酶分布到每个角落，之后倾去胰酶，加3ml培养基（我认为加血清过于粘稠，不宜吹打，加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤），吹打成单个细胞；
3、接种时要注意细胞密度，多数细胞要求0.5-2的10的4次幂，这也要摸索一下（简单：就是你种一个密度，如果在你测指标时细胞没过多影响结果就行）；
4、周边的孔不要做指标检测孔，你有没有发现周边的孔的细胞2天后状态就明显不好了；
5、接种细胞调整好浓度后，要一边吹细胞悬液一边接种；
6、还有你说看不清细胞，你注意到没有，当把培养板那出孵箱一会，培养板盖就有一层雾，会影响观察细胞，你是不是这个问题？？
（2）问：我在96孔培养板上接种的细胞很均匀，但换液时，我用枪加150ul的培养基加入每个孔内，结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了，而中间的细胞层叠成致密的团块.请问这样的细胞对实验有影响吗?有其他的好办法吗？ 是3T3-L1前脂肪细胞，要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以我每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗？
答：我们实验室一般用机械吸引器吸引，吸引器管前面套一个20ul加样器的Tip头，效果不错，操作在无菌台内进行。Tip头剪去尖端后灭菌使用，加液时液体呈滴状滴入，就不会扰动孔底的细胞了。
（3）3T3-L1前脂肪细胞不是贴壁的吗？怎么会这么容易被冲到中间去？
我只听说过第一次把细胞加到孔中的时候很容易让细胞长得不均匀，3T3-L1前脂肪细胞要是贴壁了不容易被冲走了吧，要不然就不要用胰酶消化了。
建议：加液的时候沿着边轻轻的加入，动作柔和，可以避免冲动细胞；去液的时候直接甩板，方便快捷。
去液的时候不建议直接甩板，容易污染。可以剪掉tip尖，不能直接冲细胞，沿孔壁轻轻加入，液体提前在孵箱里预热10分钟，有时候液体凉也会使细胞掉下来。
是换完液马上就卷了，还是过一会儿才卷的？我觉得这个细胞状态不好的时候是容易卷的，我诱导后换维持培养液时细胞卷的很厉害，原来也以为是换液造成的，后来观察了一下不是。你在仔细分析一下，一定是换液造成的马？一般帖壁细胞换液时即使是冲也只是一小部分破掉，不会大面积掉下来的，我认为。
换完液马上就卷了，细胞好象是一大片全掉下来拉，并在浮动，然后我第二天在看时就发现细胞全堆在中间，我也没在意，继续换液.但现在是我把细胞从培养箱里拿出来肉眼就能看到每个孔中间有一个小白点.我以为是污染了，拿到显微镜下看又不太像，自己感觉是细胞叠在一起长的太密了.因为能看到很致密的细胞团.而周围的细胞轮廓很清晰，但不是很多.为这个实验我已经铺了5块96孔板了，真不想再这样继续盲目下去.
我在96孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液，这样细胞就不会被冲走了，至于换液的间隔与细胞有关，我诱导肝细胞是隔天半量换液。如果卷得特别厉害，很可能是细胞的问题，建议更新细胞株。
（4）问：我的细胞对胰酶和EDTA不管用．高浓度胰酶可以，但细胞存活率不高．有没有小的细胞刮匙，（或者自制刮匙的方法），可以用于96孔板？（我在建细胞系，非得用96孔板），谢谢。
答：一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧，都不太好消化，如果建系的话最好不用刮的方法，还是消化比较好！消化时以下几点注意了吗？
消化前用D-Hanks冲洗了吗？可以冲洗2-3遍。
适当增加胰酶浓度，提高胰酶PH值到8，减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入37度培养箱。
如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶，有的细胞对胶原酶敏感。
市场上有买细胞刮刀，但是我用过的型号不适用与96孔。我在做96孔单克隆时一般采用酶消化法。 同意上楼的说法，消化前将细胞用D-Hanks冲洗，有助与消化，另外胰酶的最佳消化条件是 pH 8.0，37度最好. 如果效果还是不太好的话，可以采用多次消化方法。
（4）问：D-Hanks和PBS冲洗效果有何不同？我在胰酶消化前一直用PBS冲洗。
首先，D-Hanks和PBS冲洗细胞都可以的，我两种都用过，不过严格来说我认为D-Hanks更好，因为我们的胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改变胰酶的消化环境。
第二个问题，完全可以不用wash，加入带血清的培养基之后胰酶将完全没有作用，我一般都是这样做的，但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了。
（5）问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格 ，但不知道到底什么实验用哪种规格，请指教。
答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等！要具体根据你实验来定！
（6）问：请问哪位高手知道Terasaki板是什么培养板，与普通细胞培养板有什么区别？
答：Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting 和handing drop两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。
细胞培养板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface，有关更多实验材料上的应用与对材料的选择。
问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板 多孔细胞培养板有什么区别？
答：用多空细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。
区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。如下是个用酶标板检测冠状病毒IgM/IgG抗体例子：
【操作步骤】
1．加样品：将标本稀释液100ul（或2滴）加到包被板内（预留阴阳性及空白对照2－5孔），将待检血清用PBS或生理盐水按1：20稀释后取10ul加入反应孔内。
2．加对照：加入阴性对照1－3孔，阳性对照1孔，各100ul对照血清。空白对照1孔空置。
3．温育：将反应板震荡使样品混匀后，置37℃温箱或水浴反应20分钟。
4．洗板：用蒸馏水将浓缩洗涤液15ml稀释至300ml。
（1）手洗：将反应板孔内容物倾出，将洗涤液注满反应孔，放置30秒钟后用力甩去，如此重复5次后拍干。
（2）机洗：5次，每孔注入洗涤液200ul或注满，停留30秒钟后吸尽拍干。
5．加酶标工作液：每孔加入100ul（或2滴）酶标工作液，置37℃温箱反应20分钟后，洗板5次，洗板操作同步骤4。
6．显色和终止反应：将底物A、B液各50ul（或1滴）加到反应孔内，37℃避光显色10分钟。每孔加入终止液50ul（或1滴）混匀终止反应。
【结果判定】
1．酶标仪设定波长450nm，先用空白调零，然后测定各孔OD值；如果选用双波长测定，不必设置空白对照孔。
2．当阴性对照平均OD值小于0.08，阳性对照（pc）OD值大于0.30时，说明试剂盒有效且实验操作正确，否则应当重复试验。
3．临界值（CUT—OFF VALUE）＝0.15＋阴性对照平均（NC）OD值（当阴性平均OD值小于0.05时，按0.05计算；当阴性平均OD值大于或等于等于0.05时按实际值计算）。
4．标本OD值≤临界值为阴性，标本OD值>临界值为阳性。
常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3 mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
培养器皿 面积（cm2）培养液量（ml） 细胞量
96 孔培养板 0.32 0.1 10e5
24孔培养板 2 1.0 5×10e5
12孔培养板 4.5 2.0 10e6
6孔培养板 9.6 2.5 2.5×10e6
3.5 cm 培养皿 8 3.0 2×10e6
6 cm 培养皿 21 5.0 5.2×10e6
10 cm 培养皿 55 10.0 13.7×10e6
25cm2 培养瓶 25 5.0 5×10e6
75cm2 培养瓶 75 15～30 2×10e7
二、细胞培养板的包被
1、多聚赖氨酸包被
（1）问：我要培养原代神经细胞培养，要用多聚赖氨酸铺细胞培养板，请问赖氨酸液怎么配，怎样铺扳子
答：配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将 少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。 注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效 过滤200ml。
铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。
首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。
取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。
最后将铺好的板子放于培养箱待用。
如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。
（2）问：PLL的分子量有3-5万，7-15万，15-30万几种，应怎样选择？？谢谢：）
答：我们养神经细胞，用的是分子量3万到7万的pll 。
以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。使用时，用高纯度的蒸馏水稀释成0.11mg/ml的使用浓度，过滤除菌，以50微升每平方厘米的量均匀涂于培养底物的表面，室温下静置5min，吸除多余液体，股风吹干即可。
（3）问：多聚赖氨酸包被培养板后看上去应该是什么样的？？
要做原代培养，为了促进细胞贴壁，拟用PLL包被培养板。
1.我买的是博士德分装Sigma的10ml的那种，可是院子里搜了一下，有人说没有做过细胞培养试验，不确定能否用于细胞培养！！这怎么办，不能用么？
2.我的方法是这样的，取了0.5ml，加入5毫升灭菌去离子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（准备以后做免疫组化直接取片子的），一个孔一份，室温5分钟后吸掉液体，超净台内吹干过夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外线照一会儿再用。请问这样做有没有硬伤？？
3.包被好后的板底及玻片应该是什么样的呢？？我发现板子干了以后，上面有些白点点，一开始以为是水滴，后来发现不是。莫非是PLL，那也是不是太夸张了？？请问这种现象正常否？？
PDL有用于组化玻片包被的不能用于细胞培养，你在用前需先确定是细胞培养级的，细胞培养板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有颗粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下说明书。
我包被完用无菌水洗板子2－3次，吹干后很干净，以前用PBS洗，吹干后也发现有白点，考虑是PBS中的盐沉淀。
2、明胶包被
（1）问：在细胞原代培养时，在培养瓶里铺明胶，国产的明胶也以可用吗？它是用什么配置呢？还有怎么消毒明胶呢？请多指教，谢谢！
答：国产明胶不太好用，明胶可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分钟，趁热分装，分装后放在4度，不要冰冻。
（2）问：明胶消毒之后可以放置多长时间？还是现配现用呢？你说的分装是指直接铺在培养瓶吗？如果不是的话，放在4度冰箱不是已经固定了吗？固定之后有怎么铺在培养瓶呢？因为是没做过实验所以很不明白。
答：sigma 有现成的终浓度是2%的明胶，已消毒，买来即可使用，方便而且不贵，仅100多块钱。4度时明胶是胶冻状，室温下放置20-30分钟就可变成液态，说明书上建议使用的包被密度是5-10ug/cm2。
国产明胶就可以的，用去离子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用时取你所需量高压灭菌即可。灭菌结束取出稍凉就可以铺在培养瓶中。
（3）问：明胶包板完毕后，培养皿要干燥呢还是保持湿润？
答：明胶包被培养板或培养瓶24小时后， 将明胶倒掉，用培养基冲洗，就可以接种细胞了。
（3）问：在园里搜索了一下关于明胶在细胞培养中的使用问题，还是有很多问题大家没有详细和标准的说明，现有几个具体问题，请教各位战友。
1.明胶溶液配置的问题:用无菌PBS配还是用去离子水配?我们实验室有国产的明胶，很大一瓶的那种，能不能用于细胞培养?难道一定要用GIBCO 20ML即用型的?
2.明胶使用浓度的问题:有说0.1%，1%和2%的，我养的是内皮细胞，应该用哪种浓度呢?
3.明胶消毒的问题:有人说可以高温高压灭菌，有人说应该要过滤。。。还有人说要先高压再乘热过滤?不会吧，到底要怎样?晕啊~~~
4.明胶包被培养瓶的问题:有人说包被后置培养箱过夜，用时在弃溶掉的，加PBS和培养液冲洗。。也有人说包被后吹干30min-60min 。再加培养液冲洗即可用，到底怎么个做法啊
5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题:包被后的培养瓶能够用多久呢?有文献说包被7天，干2-3天后放4度保存可以在两周内使用。
答：Q1.明胶溶液配置的问题
A1: 用去离子水来配即可。国产的行不行要去试验，保险的就是买进口的。其实通常是买Sigma的gelatin粉末来配就好了，不用买配好现成的。配好的浓缩液可分装放-20度长期保存，即将要用的浓缩液可放4度来借用。
Q2.明胶使用浓度的问题
A2:1%是浓缩母液的浓度，使用前才取滴量稀释成0.1%来包被。
Q3.明胶消毒的问题:
A3: Gelatin是用高温高压杀菌的， 其他你所说的方法也不是不能用， 只是没必要。
Q4.明胶包被培养瓶的问题
A4:通常是包被1小时就够了，然后吸干，不需要清洗。因为你配gelatin溶液中并没有含其他有害的物质， 冲洗只是多了一道没必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。
Q5.明胶包被后的培养瓶使用期的问题
A5.这个我不知道，但基本上是越快使用越好。由于包被的过程很快，所以我都是当天包被， 在等的过程中可以去做其他的事，包被即将完成的前20分钟就开始处理细胞，等细胞收下来包被也就做好了， 马上就用。
0.1%的明胶适合大多数细胞培养时的包被，在四度放置不会出现凝胶状。我参考的文献说内皮细胞用1％的明胶包被，也就是母液，它在四度放置时会适度凝结。我的内皮细胞用1%的明胶包被效果我觉得还不错。
不管你用包被1小时的方法还是包被4小时的方法，都最好从包被开始到使用的间隔不超过一天，包被的容器放置时间越长越不好。
3、纤连蛋白（(Fibronectin， FN）包被
因为课题需要，我要养人外周血来源内皮细胞，得先用human fibronectin包被培养板。但是昨晚我看了个通宵，把园子里关于FN包被培养板的帖子大致浏览了一遍，反而越看越糊涂了——几乎就是百家争鸣的局面：
从稀释融解开始，有人说不能用三蒸水，要用制药用的纯水，否则PH值不对会影响活力；有人说用PBS，有人说用加了尿素的PBS；母液的浓度一般说是1mg/ml，但是买来的FN一般就是1mg，按这个浓度配置母液只能得到1ml，这么小的量如何分装啊？
至于包被的浓度，差异更是很大，有人说各个公司的产品不一样，还是以说明书上说的为准，是不是这样啊？
另外，包被的方法，有4度过夜的，有37度过夜的，有37度2至3个小时的，还有四度过夜或37度2至3个小时的……
我买的是ROCHE的1mg装human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后对各种方案进行了摸索，结果见下面的帖子。
刚刚又再看了一下浓度的问题，大致归结为以下三种方案：
1.园子里大部分战友用的还是50微克/毫升的浓度，室温或37度下放置30至40分钟。
2.我请教了有的人用的是10微克/毫升，4度过夜。
3.还有我见一篇文献《成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化》中南大学学报(医学版)J Cent South Univ (M ed Sci) 2005， 30 (5)上面写的是1微克/毫升，37度过夜。
至此产生一个疑问：是不是这几种方案都可行？浓度越高的，需要的温度就越低，时间就越短，而最后达到的效果是一样的？
如果真是这样，那么以上3个方案是一个比一个便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案贵了五十倍啊！比第2方案也贵了五倍。
非得花那么多钱吗？FN不便宜啊！
各位战友，我摸索了好几次，总共试验了以下方案：
1.50ug/ml，4度过夜；
2.10ug/ml，4度过夜；
3.50ug/ml，室温下放置45分钟至一小时；
4.10ug/ml，37度过夜；
5.1ug/ml，37度过夜。
现在养到了第四天，自我感觉贴壁效果最好的是方案4，而且该方案所用的FN还是方案2用过一次的，我把它回收了又重复利用，已经经过了一次冻融，按理说效果应该下降了不少了，但是它的贴壁时间早，细胞多而且形态比较接近长梭形，还聚集形成了很多集落样的结构，如下图：
至于溶解分装，我是用灭菌注射用水1ml将其溶解为1mg/ml，然后分装为八支EP管，负二十度保存。
我要用人纤连蛋白包被培养板养细胞，请问自己如何包被，有无其他方法可替代？
以10μg/μl的纤连蛋白(Fibronectin)于4℃包被培养板过夜，接种细胞就可以了。
我用罗氏的Fibronectin 1mg/瓶，说明书推荐：配成50ug/ml，包被用量5ug/平方厘米。室温下包被40分钟，然后吸掉多余溶液，注意培养板不能干掉，包被后立即使用，可用PBS冲洗，但没必要。具体浓度可根据实际需要调整(1～5ug/cm2)
4、刀豆蛋白A包被
（1）问：我现在进行胰腺细胞培养，需要用刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被细胞培养板。却不知如何使用。想请教各位：Con A用什么溶液溶解、多大浓度、包被需要多长时间。
答：包被液：Buffer A 碳酸盐缓冲液（PH 9.5 0.05M），Na2CO3.10H2O 0.107g ，NaHCO3 0.073g ，二蒸H2O 25ml
包被液：10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原（5ug/ml）每孔100ul 。
5、肝素化
（1）问：如何肝素化培养皿或细胞培养板，用于细胞与全血的共同培养 ？
答：用1250-2500 u/ml的肝素，湿润培养皿或板，然后倾去既可。
6、病毒包被
（1）问：我要做间接ELISA检测抗体。要先把病毒包培养板，不知道怎么做！
答：我也没做过， 但我觉得病毒事实上也是蛋白颗粒，，在物理性质上与普通蛋白无异，因此我觉得就是一个普通蛋白的包板而已。用碳酸盐缓冲溶液。。4度过夜就行。。。，。。。
首先将病毒用包被缓冲液稀释成最佳浓度包被，四度冰箱过夜。次日用洗涤液洗涤3 次。再将一抗加入其中。最后加入酶标抗体。
最重要的一点，为防止病毒的扩散传播，一般事先都灭活才包被。
7、anti-CD3单抗包被
（1）问：soluble anti-CD3单抗包被培养板时用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释，请问PH9.6的碳酸盐缓冲液的配方是什么。另外IL-2在培养体系中用U/ml和ng/ml，请问这如何换算。
答：包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）：精密称取碳酸钠 0.32g ，碳酸氢钠 0.586g ，加水溶解，定容至200ml。
U/m是细胞因子的活性单位，细胞因子作用于特定的靶细胞，影响靶细胞的生物活性或细胞增殖动力学，通过检测靶细胞的生物学活性或细胞增殖动力学变化，可间接反应细胞因子水平，所以生物学方法检测结果表示为相对单位或生物活性单位，一般是通过与细胞因子标准品的所测结果进行对照得出生物活性单位。而ng/ml是一个浓度单位，是通过免疫学检测方法得到的一个定量结果，检测的是细胞因子以及与细胞因子有交叉抗原的细胞因子前体等，常用ELISA法，如多克隆抗体和单克隆抗体，识别不同表位两种单抗的双抗体夹心法。由于结构和功能的不一致性，以及其它因素干扰，免疫学测定法和生物学测定法结果并不等同，所以两种单位之间也是无法换算的。必要时，可同时进行检测。
三、细胞培养板清洗和消毒
1、培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。
1、培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。
（1）问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作?
答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。
我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<20 cm）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。
其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）
我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<30 cm）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。
我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板子，也不是很贵。
我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。
永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。
紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？
板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法。
同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30-60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子，旧板子做，结果不准。
泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。
1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。
2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。
2、细胞培养与MTT
（1）问：做MTT时，96孔培养板细胞浓度该是多少？
答：我觉得细胞的浓度并不需要那么精确，关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。
比如我做MTT，起初用的细胞浓度为5 000/ml，每孔100 ul，培养3天观察，发现细胞数太少，各孔OD值反面难于比较。后来我换用10 000/ml，结果就很好。
当然细胞数也不能太多，这其实取决于你细胞的生长速度，生长快的细胞，可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因素之外的其他因素影响，比如接触抑制，营养竞争。
总之，做MTT时细胞数应较低，目的就是为了排除其他因素的影响，以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。
细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的，每孔接种多少的一个标准。当然，可以用楼上建议的浓度开始摸索。同时，注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不一样，前者生长快，后者慢，细胞数的量也有讲究。到底多少合适，得根据你的实验具体要求来摸索。我做b16转染时，因为脂质体要求细胞融合度为30%-50%，曾经没孔接种过300-500个细胞，效果非常好。
（2）问：我做的MTT为什么同一组的两孔差别那么大呢？做了两次都是这样。
答：产生差别的原因有多种：
1.在加细胞时，细胞沉淀下来，导致两孔细胞数不同。我们通常用磁力转子对细胞缓慢搅拌，时刻保持细胞处于悬浮状态。
2.96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。
对于生长较快的细胞，每12小时到24小时就传代一次的细胞，应该起始浓度低一些，我一般是96孔板每孔加10 4个细胞，培养液每孔加200 ul。
有些细胞生长较慢，例如72小时才传代一次，或者是原代细胞，起始浓度应高一些，我一般是96孔板每孔加2X10 4个细胞，培养液每孔加200ul。
（3）问：96孔板培养板能否代替酶标板测吸光度？是可以拆成一条一条的那种好还是不可以拆的好？
答：
答：
1.最好是用酶标板，因为96孔板的各孔透光性不一致;
2.拆成一条条的方便使用一些。
MTT法计数细胞的相对数，可以对96孔板培养的细胞在用药物刺激后的直接计数；也可以把细胞制备成细胞悬液，加到96孔板中，然后加MTT孵育、计数。
所以，如果是前者，必须用培养板；如果是后者，可以用酶标板。平底的，酶标板好一些。
（4）问：我的干预因素是乳剂（白色），对结果可能会有影响吧，如何才能减少这些干扰?
答：当然可以用，如果你害怕干扰因素对实验产生影响，那么建议你设定一空白调零孔，如100ul的培养基加上10ul的药物，测定的样品吸光度减去空白调零孔即可。
测单一时间点的OD值，直接在培养板里就是了。测不同时间点的，需要在不同的培养板里。细胞在培养板里侧就是了。干扰因素可以测前离心一下。
（5）问：看到很多讨论说 96孔四周不做数据处理，那么还是要加细胞或培养基吗？如果我把四周设为空白孔（不加细胞）作为阴性对照，可以用来调零或计算抑制率不？
答：可用只加培养基组作为正常对照组，来计算细胞生存率=给药组MTT/正常组MTT×100%，余空可不加任何物质。 MTT不同与做ELISA需要设立空白对照、阴性对照和阳性对照，这其中的空白对照一般用PBS，目的是去除板底效应。
实际上，对于96孔板的细胞培养可以采取一个方法来改变出现误差的情况，就是将你的分组打乱，不要让你同一组的细胞集中排在一个区域，尽量打乱，就可以了。
首先，分析原因，即必须知道在96孔板四周做数据处理会有什么影响。
因为96孔板的密封性比较良好，也就是说培养箱内空气中的O2是透过板四周很小的空隙进入培养板的，细胞代谢产生的CO2也是通过四周空隙从板内排出来的。在板内外气体交换时，37度条件下，板内的水汽也被大量带出板外。
这样，就会造成96孔四周孔内的体积减少，如果细心一点，就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。因此，如果最外一周有细胞进行培养，则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响，同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时，药物浓度偏高而对测定结果有影响。
这样，就会造成96孔四周孔内的体积减少，如果细心一点，就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。因此，如果最外一周有细胞进行培养，则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响，同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时，药物浓度偏高而对测定结果有影响。
因此，在具体操作时，可以采用以下对策：
知道原因，我们可以跟据实验情况选择PBS或D－Hanks溶液，因为外周加入这种成本低廉的溶液，一方面可以减少内部各孔中细胞培养液中水份的损失，另一方面，可以做为分析染菌等突发事故的原因，进行排查，找到染菌源头。当然，因为作MTT时，你本身会做空白对照与阳性对照，所以你可以完全不用管本底带来的误差了（建议你采用中间列6个孔为空白对照组，剩下共有9组54个孔，正好可以做三个药，每个药可设高、中、低三个浓度；加细胞时，你采用随机加细胞法，反正60孔细胞你加满就可以放心去培养了）。
3、细胞培养板与ELISA
（1）问：请教各位，做ELISA能否用培养板呢，有什么差别呢？
答：应该用ELISA试验专用板子。细胞培养板是不行的。ELISA专用板条，是经过处理的，要求每孔的均一性要好；而细胞培养板同样经过处理，但是是为了细胞更好地贴壁生长，使用细胞培养板可能会造成孔与孔之间的显色没有可比性。
所以，细胞培养板可以做要求不严格的定性ELISA实验，而其他情况，应当使用正规ELISA板条。
（2）问：大家的ELisa板有没有重复利用啊，我们这里重复利用，但是没有洗板机，就人工洗一下，然后煮沸，再烘干，不知这样是否合理啊，我感觉还是新板的效果好些，还请高手指教。
答：细胞培养板用于定性或要求不是很高还可以，对于定量试剂最好用酶标板，可以提高均一性减少差异，而且强吸附酶标板还可以减少包被抗原或抗体的用量，因此最好用酶标板。
ELisa板一般不能重复利用。一是对板子均匀性的要求高，重复使用难达到。二是不划算，一块板子的试剂便宜的要几百元，贵的要几千元，而一块空板贵的也就几十元，便宜的还不到10元，再将样本的价格和耗费的时间加上，而得到不靠的结果，你说应该如何办？
洗板机不是清洗重复使用板子的，而是在加样过程中为了提高自动化程度洗板子用的（洗涤是ELISA实验步骤之一）。
4、细胞培养板与免疫组化
（1）问：在塑料的细胞培养板上，进行免疫组化应当怎样合适，有没有这样的技巧？
答：完全没有什么特别的，只是在最后封片的时候，有些不同。还有需要注意的是每一步加液体时应从培养孔的壁上轻轻加上。使液体慢慢到达孔底，我第一次作时，没注意到这一点，到最后细胞所剩无几，所以虽是细节问题，但很重要 。
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