在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。

它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。

Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。

“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于 能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下：

单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口

在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”

选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”

出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”

出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的 出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。

∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：） Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。

再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3

出现以下窗口，点OK就OK了。当然你也可以点击“Prameters”和“Search Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。

出现Search Status窗口，点“OK”

出现Primer pairs窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量

点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。

关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。

至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。

当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。

首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。

二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。好了，oligo使用的简单介绍到此结束。谢谢各位！

[注] 以上很多文字说明均摘自中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所张新宇，高燕宁的"PCR引物设计及软件使用技巧"

本文来源于丁香园论坛，作者：houliping，http://www.dxy.cn/bbs/thread/1383945#1383945

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