单克隆抗体制备主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。

1 动物免疫

根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。

（1）初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般 1.5 ml, 间隔 3 周。

（2）第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔 3 周。

（3）第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7 天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔 3 周。

（4）加强免疫，剂量 50ug，腹腔注射。

（5）3 天后，取脾融合。

2 细胞融合

（1）饲养细胞的制备

在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞

小鼠腹腔巨噬细胞的准备：

①用 6-10 周龄的 BALB/c 小鼠。

②拉颈处死，浸泡于 75% 的酒精，消毒 3 min, 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入 6 ml 培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。

③放入 10 ml 离心管，1200rpm 离心 5 min.

④用 20% 小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为 1*105/ml. 加入 96 孔板，100ul/孔。放入 37 度孵箱培养。

（2）骨髓瘤细胞的准备

①于融合前 48-36 小时，将骨髓瘤细胞扩大培养

②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于 50 ml 离心管或融合管内。

③1000r/min 离心 5-10 分钟，弃去上清。

④加入 30 ml 不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于 10 ml 不完全培养基，混匀。

⑤取骨髓瘤细胞悬液，加 0.4% 台酚蓝染液作活细胞计数后备用。

（3）脾细胞的准备

取已经免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75% 酒精中 5 分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10 ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠 1×108-2.5×108 个脾细胞。

（4） 细胞融合

①将 1×10^8 脾细胞与 1×10^7 骨髓瘤细胞 SP2/0 混合于一支 50 ml 融合管中，补加不完全培养基至 30 ml，充分混匀。

②1000r/min 离心 5-10 分钟，将上清尽量吸净。

③在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;

④用 1 ml 吸管在 30s 内加入预热的 50% PEG1 ml，边加边轻轻搅拌。

⑤吸入吸管静置 1 min。

⑥加入预热的不完全培养液，终止 PEG 作用，连续每 2 min 内分别加入 1 ml,2 ml,3 ml,4 ml,5 ml,10 ml.

⑦800rpm,5 分钟；弃去上清。

⑧加入 5 ml 完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至 40-50 ml。分装 96 孔细胞培养板，每孔 100ul, 然后将培养板置 37℃，5% CO2 培养箱内培养。

⑨ 6 h 后补加选择培养基。每孔 50ul. 3 天后用选择培养基半换液。

⑩. 经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出上清供抗体检测。

（5） 杂交瘤细胞的选择

①抗原用包被液稀释至 10ug/ml。

②以 100ul/孔量加入酶标板孔中，置 4℃ 过夜或 37℃ 吸附 2 小时。

③弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗 3 次，每次 3 分钟，拍干。

④每孔加 100ul 封闭液 37℃ 封闭 1 小时；

⑤洗涤液洗 3 次；

⑥每孔加 100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃ 孵育 1 小时；洗涤，拍干。

⑦加酶标第二抗体，每孔 100ul，37℃ 孵育 1 小时，洗涤，拍干。

⑧加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液 100ul，37℃20 分钟。

⑨以 2mol/L H2SO4 终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取 OD 值。

⑩结果判定：以 P/N≧2.1，或 P≧N+3SD 为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果

（6） 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）

①制备小鼠脾细胞为饲养细胞。

②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含 20% 血清的 HT 培养基稀释至每毫升含 5、10 和 20 个细胞 3 种不同的稀释度。

③按每毫升加入 5×104-1×105 细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。

④每种杂交瘤细胞分装 96 孔板一块，每孔量为 100ul.

⑤37℃、5% CO2 培养 6 天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

⑥取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

3 单克隆抗体的 Ig 类与亚类的鉴定

①以 10ug/ml 浓度的抗原包被酶标板，50ul/孔，4℃ 过夜。

②洗涤后，加入待检的单抗样品，100ul/孔，37℃1 小时；设阴性、阳性对照孔。

③洗涤后，加入 HRP 标记的抗小鼠类及亚类 Ig 的抗体试剂，100ul/孔，37℃ 避光显色 20 分钟；用 2mol/L H2SO4 终止反应后，根据颜色判断抗体的亚型。

3 单克隆抗体的生产及纯化

（1） 动物体内生产单抗

①成年 BALB/c 小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠 0.3-0.5 ml。

②7-10 天后腹腔接种用 PBS 或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠 5×105/0.2 ml。

③间隔 5 天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采 3 ml 腹水；

④将腹水离心（2000r/min 5 分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃ 冻存备用。

（2） 单克隆抗体的纯化（辛酸-硫酸铵沉淀法）

① 腹水 4℃ 12000rpm 离心 15 min, 去除杂质。

②取 1 份腹水加 2 份 0.06mol/L PH5.0 醋酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加 33ul 辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，室温混合 30 min

③ 4℃ 静置 2 小时，取出 12000 g 离心 30 分钟，弃沉淀；

④上清经尼龙筛过滤，于 50 倍体积的 0.01MPH7.4 PBS 中 4℃ 透析 6 h.

⑤在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。

⑥ 4℃ 静置 1 h 以上，10000 g 离心 30 分钟，弃上清。

⑦沉淀溶于适量 PBS（含 137 mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA） 中，于 50-100 倍体积的 PBS 中透析过夜。

⑧取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE， WB 检测抗体纯度。