一、细胞凋亡的形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜

（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3、透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

结果 [图4、图5]

注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

三、线粒体膜势能的检测

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37℃平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

注意事项

1、始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

四、DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1、大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2、 DNA Ladder 测定

方法：收获细胞（1′107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4℃过夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。结果：[图6]参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法：收集细胞?70%冷乙醇（in PBS）4℃固定过夜?PBS洗涤，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37℃消化30min?PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。结果：[图8]

4、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

五、TUNEL法
细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测
　　
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1、Western blot 分析

Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4℃过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：[图9-1、图9-2]

2、荧光分光光度计分析

原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

结果：[图10]

3、流式细胞术分析

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

结果：[图11]

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析

材料试剂：

FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。

仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计

方法：

1、悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4℃反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。

结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图12]

2、贴壁细胞的原位染色

（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

结果观察：[图13]

3、临床病理切片的染色、检测。

4、原代细胞的培养、检测。

5、分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位

（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病

1、 ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。

材料和试剂：

（1）包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer

（2）洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20

（3）封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）

（4）酶标抗体的稀释：用封闭液稀释

（5）OPD底物Buffer：Na₂HPO₄12H₂O 1.84g；柠檬酸 0.51g ；DDW 100ml

（6）显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml；OPD 2mg；30% H2O2 2ml

（7）终止液 2Mol/L H₂SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA ，Reader（OD490nm），洗板机

操作步骤

（1）用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37℃孵育2h或4℃过夜（一般24h以上）。

（2）洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37℃孵育2h或4℃过夜。

（3）洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

（4）洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37℃孵育1h。

（5）洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

（6）加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

（7）ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2、Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

请问hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342主要用于悬浮细胞，而hoechst33258主要用于贴壁细胞？如果我用hoechst33258和PI做双标，应该怎么办特别是 细胞怎么处理？谢谢

丁香网友midas认为：hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！这么说来，如果您用hoechst和PI做对活细胞进行双标，那么就最好选择hoechst33342，这是就可以直接将染料加入培养液中，之后固定观察；但是如果一定要用hoechsts33258，那么就最好是：固定－－>染色－－>观察。

我最近的实验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很容易污染，不知各位高手有何高招。

丁香网友midas认为：载玻片、PLL、六孔板、培养液及玻片确保无菌，最重要的无菌操作技术！

细胞凋亡的图片1

细胞凋亡的图片2

细胞凋亡的图片3：组织培养中内皮细胞的 apoptosis

细胞凋亡的图片4

细胞凋亡的图片5

细胞凋亡的图片6

细胞凋亡的研究方法

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。

二、区分凋亡和坏死

可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。

不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。

三、样品来源不同选择

组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。

培养的细胞：几乎所有方法

1、早期检测:

（1）PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测

（2）细胞内氧化还原状态改变的检测

（3）细胞色素C的定位检测

（4） 线粒体膜电位变化的检测

2、晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。

对于晚期检测通常有以下方法：

（1）TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)

（2）LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

（3） Telemerase Detection (端粒酶检测)

形态学观察

普通光学显微镜观察；透射电子显微镜观察；荧光显微镜观察

普通光镜下观察：

用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失

Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色

直接用倒置显微镜观察：细胞体积变小，全面皱缩；凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

透射电子显微镜观察：

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

荧光显微镜

常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB。其中Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

注意事项

细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

生化检测

典型的生化特征：DNA 片段化

检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等

TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）
 
通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。

其它方法：

Telemerase Detection (端粒酶检测)

端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。

mRNA水平的检测：

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

细胞内氧化还原状态改变的检测：
 
正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

细胞色素C的定位检测：

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

线粒体膜电位变化的检测：

线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系。近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。　　

形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；

凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；

流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。

用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。

PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

PI和Annexin-V双标：

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性 。

请教我做大鼠骨组织切片的细胞凋亡，如果要用电镜来检测的话，是否新鲜取骨后，先用10％的福尔马林固定24小时后，脱钙，然后在切成1mm厚的片子，制成电镜标本，在按照具体要求操作？非常感谢！

丁香网友yunfenglin认为作电镜检查不可已用福尔马林来固定啊，会严重破坏细胞内结构，最好选用4%戊二醛 其次为多聚甲醛。固定时间不同的人有不同习惯，脱钙最好交给电镜室的人来做，不要自己脱钙，切记固定液不用福尔马林啊

细胞凋亡的分子生物学检测方法

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

过氧化物酶标记测定法

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

一、试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H₂O₂的PBS缓冲液（pH7.4）：H₂O₂ 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。

4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH₂O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。

5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。

6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH₂O 1000ml

7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。

8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。

9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）

二、实验步骤

1、标本预处理：

（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。

（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 10⁷个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6、 组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。

9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

三、注意事项

一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。

丁香网友医琳师妹所作的PC12细胞培养方法以及诱导凋亡的方法：
PC12细胞培养方法

一、器具：
1、培养皿（35mm）（或50cm2培养瓶）
2、6孔（35mm）培养板、24孔培养板
3、滴管
4、小青瓶
5、100ml、250ml玻璃瓶
6、翻口橡皮塞
7、烧杯：1000ml、500ml、100ml、50ml
8、容量瓶：1000ml、500ml、100ml
9、量筒：50ml、100ml、250ml
10、玻璃棒
11、pH试纸
12、滤器（0.22μl，γ射线菌一次性使用）
13、注射器：10ml、20ml
14、24mm×24mm盖玻片

二、器具处理：

玻璃器皿、塑料器皿，予清洗、泡酸、三蒸水冲洗，干燥后备用。然后高压蒸气灭菌，置超净台紫外线灯照，风机抽干。

三、试剂：
1、培养基：DMEM（高糖）（或RPMI-1640）
2、马血清（56℃，30分钟灭活）
3、胎牛血清（56℃，30分钟灭活）
4、青霉素
5、链霉素
6、NaHCO₃
7、HCl
8、谷胺酰胺（选用）
9、神经生长因子（选用）
10、磷酸二氢钠
11、磷酸氢二钠
12、氯化钠
13、多聚甲醛
14、胰蛋白酶
15、NaOH（选用）
16、多聚赖氨酸（或鼠尾胶）
17、D-Hank’s液
18、乙醇（无水、75%、95%）

四、配试剂：

1、DMEM不完全培养基：
DMEM
Hepes 3.08g
NaHCO₃ 3.7g
100U/ml青霉素/100mg/L链霉素
（调PH至7.2-7.4），不加血清为不完全培养基。

2、100U/ml青霉素/100mg/L链霉素：
青霉素80万U+NS→40ml
链霉素100mg/L+NS→50ml取40ml
混成80ml，抽滤分装，4℃保存。

3、DMEM完全培养液
DMEM
10%胎牛血清（已灭活）
5%马血清
调pH7.2-7.4
加100U/ml青霉素、100mg/L链霉素约1ml

4、RPMI1640不完全培养液：
RPMI1640，25mM HEPES，用5%NaHCO3调节pH至7.4，灭菌后4℃保存，即：
RPMI-1640 10.4g
Hepes 3.58g
三蒸水 1000ml
1N NaHCO₃（或NaOH）调pH值至7.2-7.4抽滤分装90ml/瓶，4℃或-20℃冻存。

5、RPMI1640完全培养液：
25mM HEPES，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，100U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素及20%FCS，用5%NaHCO₃调节pH至7.4，灭菌后4℃保存。
RPMI-1640不完全培养液，加100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素，临用前加入10%或20%FCS（v/v，胎牛血清），用1N NaHCO3调节pH值7.4，抽滤灭菌后4℃保存。

6、0.25%胰蛋白酶（DMEM配）
胰蛋白酶250mg
DMEM 100ml
抽滤分装小青瓶，-20℃冻存

7、0.25%胰蛋白酶（RPMI 1640配）
胰酶250mg，加RPMI 1640 100ml，用0.1N NaHCO₃调节pH至7.4，灭菌后4℃保存。

8、 Hank’s平衡盐溶液：5.4mM KCl, 0.3mM Na₂HPO₄, 0.4mM KH₂PO₄, 4.2mM NaHCO₃, 1.3mM CaCl₂, 0.5mM mgCl₂, 0.6mM MgSO₄, 137mM NaCl, 5.6 mM D-葡萄糖，0.02%(w/v)酚红。

9、0.1M pH7.4 PBS:
137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄•7H2O, 1.4mM KH₂PO₄。

10、1%多聚甲醛：多聚甲醛1g，加0.01M pH7.4 PBS至100ml。

11、抗体稀释缓冲液：0.01M PBS, 0.1%BSA, 0.1Na₃N。

12、小牛血清：
56℃，灭活30分钟
分装小青瓶，10ml或20ml/瓶

13、马血清：
56℃，灭活30分钟
分装小青瓶，10ml或20ml/瓶

14、0.1M PBS:
137mM NaCl
2.7mM KCl
4.3mM Na₂HPO₄•7H₂O
1.4mM KH₂PO₄

15、7.4%NaHCO₃
NaHCO₃ 7.4g
双蒸水 100ml
抽滤分装小青瓶，4℃保存。

16、0.1N HCl
1N HCl 10ml
双蒸水 100ml
抽滤分装小青瓶，4℃保存。

17、多聚赖氨酸（包被用）：
多聚赖氨酸氢溴化物溶解于150m mol/L硼酸钠缓冲液中，（pH8.4），终浓度为1mg/ml，抽滤灭菌。（玻璃器皿可用50μg/ml多聚-L赖氨酸氢溴化物的水溶液。）

18、神经生长因子：
用pH5.0的醋酸钠缓冲液（0.1mol/L）配置NGF（2.5S）250μg/ml贮存液，使用前再用培养液稀释，贮存液的浓度太低，活性容易丧失，贮存液应冻存于-80℃，一旦冻融后不宜再冻存，所以应将其分装成小份冻存，冻融后的NGF贮存液可分装于EP管中，置于4℃贮存，其活性可保存数月。

五、操作步骤：

1、将多聚-L-赖氨酸氢溴化物（终浓度1mg/ml），经过滤除菌后用于包被培养皿，在室温作用4小时后，吸去包被溶液，并将培养皿用无菌培养用水漂洗4次，置超净台里晾干。（可再予紫外线照射20分钟灭菌）。（对玻璃器皿，可将经过滤除菌的多聚-L-赖氨酸氢溴化物水溶液50μg/ml加于玻璃器皿表面包被1小时，然后用无菌培养用水漂洗4次，并置超净台内空气干燥。

2、将PC12细胞（2×104或2×105）接种于含10%胎牛血清、5%马血清， 100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM完全培养液（pH7.2）的塑料培养瓶（或培养皿）中。

3、置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

4、细胞接种后，每2-3天换液一次。每次更换约2/3的培养液，并在倒置显微镜下观察PC12细胞是否贴壁。

5、80-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，D-Hank’s液收集细胞，调整细胞数。转种到6孔培养板中（可以先用多聚赖氨酸包被）。接种密度为5×10⁵/ml.孵育48h后作为实验细胞。（有人每周按1：4传代）。如准备用于激光共聚焦显微镜照相，可先将处理过的24mm×24mm盖玻片，再转种细胞到6孔培养板中。

6、吸去培养液，用D-Hanks液洗2遍，每孔加入含干预药物的无血清DMEM不完全培养液适当时间，可以进行测定增殖、凋亡或细胞周期情况。

7、简述：（南医大神经药理）将PC12细胞接种于培养液中，培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2条件下培养，待细胞长满瓶底后，倾去培养液，用D-Hank’s液轻轻荡洗两次，用吸管轻轻吹打数次，使细胞完全分散，倒置显微镜下观察计数，调整细胞浓度为：5×105个/ml，接种于24孔培养板，待细胞长成连续单层后，予干预。

8、神经生长因子诱导PC12细胞分化神经纤维：要求：（1）细胞密度: 2.5-10×10⁴ cell/cm²（2）塑料培养皿的包被。上述细胞培养24小时后，换入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培养液，以后隔天换液（含NGF）；取NGF分化5-10天后的PC12细胞用于实验。（一般情况下，NGF诱导10-14天时，NGF可使PC12细胞长出神经纤维，并形成致密的网络）。

9、PC12细胞凋亡模型的制备与干预：（1）无血清诱导：PC12细胞培养后用无血清的DMEM洗三次，加无血清的DMEM培养12小时，然后予各种干预。最后予4℃预冷的75%乙醇固定后，送流式细胞仪以PI（碘化丙啶）检测。（2）谷氨酸诱导：配置含80μM-10mM终浓度的谷氨酸（经典用10mM）的DMEM不完全培养液（不含血清），处理24小时（6-24小时，可偏长一点）后，再予各种干预，最后送流式细胞仪测定细胞凋亡（有人要求在无血清培养基中先培养8-24小时后，再加含10mM谷氨酸的不完全DMEM培养液培养6-24小时。）（3）缺氧诱导：首先设置低氧环境，将培养箱内充入95%氮气代替空气，同时充入5%二氧化碳，条件稳定后（5%二氧化碳：5%氧气），将细胞置入培养，分别培养30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时，取出细胞，将细胞吹打成细胞悬液，1000r/min离心30分钟，倾去上清，PBS洗涤一次，离心去上清后，迅速注入3ml 4℃70%的冷乙醇，边注入边振摇，同时反复通过7号针头的注射器抽打5次（或用振匀器振匀），以避免细胞成团，送流式细胞仪PI检测。

10、吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（细胞爬片），在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存。）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。（如制成细胞悬液，取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。）（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。）