Nature Medicine重磅：单细胞生信分析揭示新冠重症特效药地塞米松的作用机制

新冠肺炎仍在肆虐，给全球的医疗和公共卫生系统带来沉重负担。新冠重症的病死率高，已累计夺走了数百万人的生命。事实上，导致病人死亡的直接因素，不是病毒本身，而是细胞因子风暴（cytokine storm）造成的多器官衰竭¹。中性粒细胞被认为是细胞因子风暴的驱动因素之一，过度激活的中性粒细胞会导致高细胞因子血症（hypercytokinemia），以及肺部损伤²。

临床上常常使用免疫抑制剂来控制细胞因子风暴。地塞米松（dexamethasone）是一种人工合成的糖皮质激素，具有广泛的抗炎和抑制免疫作用。一项超过6000人的临床研究表明，地塞米松能够有效降低新冠重症患者的死亡风险³。然而，激素药物产生的副作用以及对疫苗的潜在拮抗影响，也使得这一疗法饱受质疑。因此，明确地塞米松在治疗新冠感染中的作用机制显得尤为重要。

最近，来自加拿大卡尔加里大学兽医学院的Sinha和Rosin等人在Nature Medicine杂志发表最新研究。研究人员设计了精巧的分组（图1），借助单细胞转录组测序技术，比较了新冠感染和细菌性呼吸道感染，以及地塞米松治疗和未经地塞米松治疗的新冠感染之间的免疫应答的异同。

图1. 试验分组示意图

相较于细菌性感染，新冠感染中的中性粒细胞遵循两条截然不同的成熟轨迹，形成两种终末状态：干扰素激活态（IFN^active）和前列腺素激活态（PG^active）（图2）。在重症型新冠肺炎中，地塞米松介导了关键基因的改变，包括下调IFITM1和激活IL-1R2，从而改变了原本会发育成IFN^active态的中性粒细胞的命运。不同于大多数研究中使用基因表达量（丰度）特征进行细胞演化的轨迹推断方法，在这项工作中，研究人员采用了一种基于RNA速度的轨迹推断的算法——scvelo⁴。

图2. 中性粒细胞成熟轨迹

RNA丰度（RNA abundance）是衡量单个细胞状态的一个有力指标，但它只能捕捉到一个时间点上的静态信息，好比是给细胞拍了一张定格快照。2018年，La Manno等人提出了RNA速度（RNA velocity）的概念，“velocity”是指带有方向的“speed”。通过估算基因表达状态的时间导数来模拟细胞的动态发育过程⁵。它的原理是，新生（未剪接）和成熟（剪接）mRNA的相对丰度可以被用来估计基因剪接和降解的速率，进而揭示动态过程中整个转录组的变化速度和方向。

2020年，Bergen等人对La Manno提出的模型进行了改良。Bergen将之前的模型称为稳态（steady-state）模型，它需要两个先决条件：所有的细胞具有相同的剪接速率且全部的剪接动态都可以被观测到。现实情况是，不同亚型或状态的细胞的剪接速率往往是不同的，且现有的技术手段无法完整捕获和检测全部的mRNA分子。为此，Bergen等人提出了一个基于似然的动态模型（likelihood-based dynamical mode）并将之实现，开发成scvelo工具。

Scvelo官网提供的示例数据很好的展示了这一工具在实际情况中的应用。示例数据描述了胰腺的内分泌发育，胰腺内分泌细胞有四个终末状态：α、β、δ和ε，都由内分泌前体细胞发育而来。图3a所示的流线图完美地表现了内分泌细胞的发育轨迹，箭头的指向表示细胞发育的方向。导管上皮细胞（墨绿色）在离开细胞循环后，生成Ngn3⁺前体细胞（橙色），进而生成不同状态的内分泌细胞。

图3.scVelo动态模型揭示胰腺内分泌细胞生成

“动态”即指随时间而改变的规律。虽然没有真实的区分时间点的采样数据，我们仍可以借助转录动态模型近似地估算出细胞分化经历的时间，称为潜在时间（latent time）。它是一个从0到1的数值，数值接近于0表示细胞接近初始或干性状态，接近于1表示趋向终末或特化状态。图3d表现了内分泌细胞发育的潜在时间，导管上皮细胞的潜在时间更早，而内分泌细胞的潜在时间更晚。

那些随时间（轨迹）改变而发生表达改变基因被认为是潜在的驱动基因，在动态模型中的表现出高似然性特征，很容易被检测出来（图3f）。图3g的散点图展现了基因在剪接和降解过程中的改变。上半部分为相图（phase portrait），x轴和y轴分别表示剪接和未剪接mRNA的占比；虚线表示未剪接和剪接的mRNA处于平衡状态；虚线上方表示未剪接（新生）mRNA处于优势，基因在加速表达；虚线下方表示剪接（成熟）mRNA处于优势，基因趋于降解；颜色可用以表示细胞状态；转折点表示在此处基因表达的速度发生改变，指示了驱动基因的表达发生重要变化时所处的细胞状态。下半部分表示表达量（y轴）随时间（x轴）的改变。如图所示，Actn4基因在离开细胞循环后表达量在不断下降；Ppp3ca在生成Ngn3+前体细胞的过程中表达持续升高，在向内分泌细胞的分化过程中，表达转而下降。Nnat在β内分泌细胞的生成过程中表达持续升高。

再回到地塞米松治疗新冠的研究中，图4e确认了中性粒细胞从未成熟状态分别分化至干扰素激活态和前列腺素激活态的轨迹，在干扰素激活态形成（commitment）之前，还经历一个IL-1R2激活的过度状态。此外还发现了一个独立的与IL7R激活相关的轨迹。

实验设计了t1和t2两个采样点，分别代表进入ICU 72小时之内和7天之后。图4g显示，在t1期使用地塞米松后，中性粒细胞的发育停滞在了IL-7R⁺激活态，不再向干扰素激活态发育，随后被耗尽（图4g），这证实其发挥了免疫抑制作用。从下图推断，接受地塞米松治疗后，IL-1R2表达被激活（图4i），而干扰素促进基因IFITM1受到抑制（图4j）。需要指出的是，原文作者使用了基于地塞米松分组比较的方式发现差异表达基因，而非scvelo作者推荐的基于动态模型的高似然性的驱动基因的发现模式。

图4

除了RNA速度分析，研究人员还运用了其他单细胞数据的高级生信分析方法，包括使用SCENIC发现标志性的转录因子，以及CellChat发现细胞间受体和配体的互作。受篇幅限制，我们在此不一一展开。读者也不必为此感到遗憾，因为我们将在明天的直播中分享更多关于单细胞高级生信的知识，带领大家全方位地理解单细胞数据挖掘的思路和方法。

【参考文献】

1. Kim, J. S. et al. Immunopathogenesis and treatment of cytokine storm in COVID-19. Theranostics 11, 316–329 (2021).

2. Vanderbeke, L. et al. Monocyte-driven atypical cytokine storm and aberrant neutrophil activation as key mediators of COVID-19 disease severity. Nat Commun 12, 4117 (2021).

3. RECOVERY Collaborative Group et al. Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med 384, 693–704 (2021).

4. Bergen, V., Lange, M., Peidli, S., Wolf, F. A. & Theis, F. J. Generalizing RNA velocity to transient cell states through dynamical modeling. Nat Biotechnol 38, 1408–1414 (2020).

5. La Manno, G. et al. RNA velocity of single cells. Nature 560, 494–498 (2018).