荧光抗体质量控制

对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
（一）染色特异性和敏感性的测定
1．特异性染色效价的测定　　
直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大释释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即2～4个单位），如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。
2．非特异性染色测定　　根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。
3．吸收试验　　在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用以染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。
4．抑制试验如前述。
（二）F/P比值的测定
F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。
1．蛋白质定量 　　测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。
2．结合荧光素定量 　先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg,溶于10ml
0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/L
pH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10 μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用 分光光度计 在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。
荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493～495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。
F/P比值的计算：可按以下公式计算。


式中160000为 抗体 蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。
测定RB200荧光 抗体 的克分子比值公式如下：


按图3-4测定法更为简便，即先用276nm波长测得蛋白质的OD值，再用493波长测得
FITC的OD值，将这两个OD值在图3-14上连成一直线，直线与各纵线交叉处，即可查出标记抗体的以下数值：FITC
μg/ml ，F/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。


图3-14　 FITC标记物中球蛋白、荧光色素和E/P比值计算图
四、荧光抗体的保存
以0～4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的叠氮钠防腐，小量分装如0.1～1ml，真空干燥后更易长期保存。