抗原设计

基于Cre/loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统 该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off(tTA依赖)系统和Tet―On(rtTA依赖)系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子Ptec的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的结合是不需要四环素的，四环素阻碍两者之间的相互作用 ...

条件性基因敲除的策略 条件性基因敲人是在特定的时期、特定的组织和器官中使某个基因获得表达，可用于研究致病基因的功能或者构建在特定的条件下、特定的组织和器官中表达某个基因的转基因动物模型。其基本原理和实施方法与前面介绍的条件性基因敲人非常相似，只不过在构建loxP转基因动物时，靶基因与启动子之间含有一段具有翻译终止密码的基因序列，导致靶基因不能正常翻译。而这段分割序列的两侧各有一个loxP位 ...

条件性基因敲除应用于研究基因的功能 层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质中的一个重要成分，在调节细胞的生长和功能方面发挥重要的作用。层粘连蛋白是一个异源三聚体，由α、β和γ亚基构成。之前的研究表明，层粘连蛋白功能的缺陷可以导致肌肉营养失调和外周神经髓鞘形成障碍。全身性层粘连蛋白基因的缺失可以导致胚胎在胚胎发育第5天即发生死亡，因此用传统的基因缺失方法无法研究层粘连蛋白基因在外周神经系统 ...

致病基因的条件性敲入，构律人类某些疾病的动物模型 利用Cre／loxP系统进行条件性基因敲人的原理与基因敲除的原理非常相似，区别只是在事先想要研究的基因编码区内引入一段翻译终止序列，并且该终止序列的两侧具有两个同向的loxP位点。在没有Cre重组酶的组织和器官中，由于翻译终止序列存在致病基因是没有活性的，在某些特定的组织器官中，当Cre重组酶出现时会导致终止序列的丢失，从而使致病基因激活， ...

基因敲除到总结和展望 经典的基因敲除将靶基因在所有的组织器官中终生灭活，这就导致许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brcal、Brca2、Dpc4/Smad4等，在敲除后引起小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatio tempora ...

条件性基因敲除应用于追踪细胞的发育命运 在胚胎发育过程中，特定器官的出现以及特定类型细胞的分化是按照细胞内的程序有条不紊地进行的，研究这些细胞的分化及迁移，对于阐明个体的发生过程、探讨某些疾病的发生机制非常重要。在研究过程中，一般会选择一种或多种特定细胞的分子标志来标记相应细胞的分化、运动以及形态的变化。但是检测这些分子标志的一般方法如RT-PCR或原位杂交等不能提供连续、动态的报告，而基 ...

噬菌怖肽库技术用于分析蛋白质的抗原表位 蛋白质的抗原表位即该蛋白质在参与抗原-抗体反应中直接与特异性抗体结合的氨基酸序列和构象。研究蛋白质的抗原表位对于了解蛋白质的结构与功能、分子识别的基础是十分重要的，也为多肽药物的筛选、疾病新型诊断抗原以及多肽疫苗的研制提供重要的依据和线索。 目前广泛用于蛋白质抗原表位的分析方法主要是肽扫描，即按照蛋白质氨基酸的序列，合成多个线形的重叠肽，再利 ...

噬菌怖肽库技术的发展历史 1982年，Dulbecco首先提出一种创造性的设想，他认为可以将病原体的抗原与入噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合并表达在其表面，这种表面表达有病原体抗原的病毒颗粒可以作为疫苗，由此第一个提出了表面展示(display)的概念并申请了美国专利。1985年，Smith首次证实了丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程技术进行这种改造，他将EcoRI核酸内切酶的部分基因片段 ...

肽库的概念和分类 肽库(peptidelibraries)是大量特定长度且序列不同的小肽的集合，它包括了该长度短肽中各种(或绝大部分)氨基酸序列的排列组合。 肽库最早是Geyson及其同事在1986年提出的，他们认为：①蛋白质分子之间的结合或识别主要是由局部肽段上数个氨基酸残基间的相互作用来完成的，这些氨基酸之间形成非共价键联系；②有些多肽虽然其序列与抗原的天然表位不同，但在结合抗体 ...

丝状噬菌体的生活史 野生型Pf类丝状噬菌体只能感染带有F性菌毛的雄性大肠杆菌。当噬菌体感染大肠杆菌时，先通过其头部的pⅢ蛋白N端吸附于大肠杆菌F性菌毛的末端，脱去主要衣壳蛋白pⅧ，其感染性单链DNA则进入宿主细胞细菌，并在10～15min内，首先在宿主胞内酶的作用下，以此环状单链的DNA为正链，通过滚环复制拷贝出互补的负链DNA，形成环状双链DiNA分子即复制型DNA(RFDNA)。这种双 ...

噬菌怖肽库技术在新型药物设计中的应用 传统药物的开发一般是从自然界的动物、植物和微生物中分离出具有特定药理作用的化学物质或蛋白质(多肽)，然后对于化学物质(一般是作为药物研究的先导化合物)再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。目前大部分药物是通过这些方法获得的，但此方法往往周期长、风险高、耗资巨大，并带有很大的 ...

噬菌怖肽库技术用于发展新型诊断抗原和疫苗 噬菌体肽库技术可以用于筛选疾病特异性抗原表位，在疾病的诊断、治疗以及新型疫苗的研制方面具有广泛的应用前景。感染或曾经感染过某种病原体的患者，其血清中往往存在有相应的病原体特异性抗体，临床上可以通过检测这些抗体来知道患者感染的状况。常规检测这些抗体的方法需要有诊断抗原，而这些抗原通常是纯化的病原体天然抗原或者是通过基因工程技术表达和纯化的重组抗原。但 ...

噬菌体表面展示方式 目前在噬菌体肽库技术中，主要用于表面展示肽库的方式有两种：pⅢ蛋白展示方式和pⅧ蛋白展示方式。展示系统又可分为噬菌体表面展示系统和噬菌粒(phagmid)表面展示系统。 噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽或蛋白质，在基因工程操作上基本相同：在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有一个可以插入外源基因片段的克隆位点，插入的外源基因编码的蛋白与pⅢ和pⅧ以融合蛋白的形式 ...

噬菌体表面展示系统 1．噬茵体展示系统 噬菌体展示系统是在野生性丝状噬菌体的基因组基础上改造而成，保留了噬菌体完成整个生活史所必需的基因，包括感染宿主、DNA复制、包装蛋白质合成以及病毒组装的基因，还包含一个抗生素的遗传标记和一个多克隆限制性酶切位点。 噬菌体载体不需要辅助噬菌体，比较稳定。但由于DNA基因组大(相对分子质量为9 000～10 000)，回收DNA的产量低， ...

噬菌体肽库技术的特点 (1)在噬菌体表面展示的融合蛋白或肽直接有效地与其编码基因密切偶联在一起，因而在获得多肽的同时通过对噬菌体单链DNA插入DNA进行测序，从而得到了多肽的编码基因。 (2)库容量大(目前可达到1010)，选择范围广泛，可能筛选到针对某个生物大分子的新型特异性结合肽，甚至是自然界中不能天然产生的但具有高亲和力的配体分子。而且筛选到的多肽结构多样，为进一步分析研究蛋 ...

构建噬菌体肽库的密码子选择 要建立一定长度的肽库，首先就是要人工合成相应长度的核苷酸随机序列，理论上核苷酸序列随机性越大，则肽库的多样性就越丰富。如密码子采用NNN合成方式，理论上可以得到所有可能且完全随机的氨基酸序列。但实际上其中有很多序列因存在着终止子而得不到表达，因此要尽量减少终止子在核苷酸序列中出现的频率。终止子有3个：TAA、TGA和TAG，因此密码子的合成方式一般选择(NNK) ...

肽库的筛选方法 噬菌体肽库筛选总的指导思想是利用有些生物大分子之间存在着不同大小的亲和力，以生物大分子为靶目标，通过直接或多轮筛选可以从肽库中筛选得到相应的且具有特定亲和力的结合肽。噬菌体肽库筛选方法一般采用生物学筛选技术，又称为生物淘洗(biopanning)，即利用生物操作方法从噬菌体随机肽库中筛选出所需的噬菌体肽。筛选方法可以因筛选靶目标的性质、筛选的规模而不同，并且与操作人员的习惯 ...

编码15肽随机DNA片段的克隆 (1)M13KE载体的大量酶切 双酶切反应体系： M13KE载体(1ug) 2 ul H2O 32 ul 10XNE Buffer 3 4 ul EagI(10 U／ul) 1 ul Acc65 1(

以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库模拟抗原的筛选 (1)将单克隆抗体用包被液CBS稀释，加入酶标板，一般抗体包被浓度为10ug/孔，包被体积为100ul/孔，稍加晃动使孔表面变湿，置于4℃下包被过夜(或37℃慢摇孵育2h)。第二天倾去板中包被液，每孔加入200ul/孔洗板液(PBST05)，静置5rain，甩去洗板液，于无菌干净的滤纸上拍打，以尽量除去剩余的液体，重复洗5次，以下的洗板操作都与 ...

以蛋白分子为靶目标噬菌体肽的鉴定 (1)ELISA鉴定：用牙签轻触筛选到的并单克隆化的含噬菌体单菌落，将其投入已放有1m1 B-Kanl00-Tet40液体培养基的15ml试管中，37℃震荡(270r/rain)培养24h。离心除去菌体，得到上清液，即单克隆的噬菌体，可直接用于鉴定。将单克隆抗体用CBS稀释成一定浓度，以100ul/孔包被96孔酶标板，于4℃下包被过夜(或37℃孵育2 h) ...