化学生物学实验技术

1．原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把125I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。　　2．方法 　（1）标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。　　（2）标记时，将蛋白质溶液10～20μg/10μl(0.5mol/LpH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中 ...

（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；　　（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；　　（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；　　（4）用DEPC水将混合物稀释至17 ...

对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。　　1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上： 　　(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。 　　(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上再转 ...

(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。 　　(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时则在68℃杂交而在50%甲酰胺溶液中时则在42℃下杂交。 　　(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardt' ...

　　（一）RIA的优点　　放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。　　1．灵敏度高一般化学分析法的检出极限为10-3～10-6g而RIA通常为10-9（毫微克，ng）、10-12g（微微克pg），甚至10-15g(毫微微克，fg)、10-18g(微微微克，ag)。　　2．特异性强由于抗原— ...

（1）用合适的酶切割DNA并电泳。　　（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。　　（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。　　（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。　　（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和 ...

　　根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序 ...

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。 亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全 ...

1 亲合杂交：在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构，杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针，用125I标记检测探针，这个系统的敏感性可检测出4×106靶分子。该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。　　2 采用多组合成探针和化学发光检测：第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们 ...

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞使之获得新的遗传性状的一种手段它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(RˉMˉ)它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法CaCl2 RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理 ...

“噪音”（noise）是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记DNA结合到空白膜上的放射性计数，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件：二是选择合适的杂交反应液和对膜进行处理。研究发现，随着离子强度的增加，空白膜（未固定DNA对照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的杂交反应液中充分封闭膜上的多余非特异结合位点。

1 HAP吸附杂交：羟基磷灰石（HAP）层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法。在液相中杂交后，DNA：DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上。通过离心使吸附有核酸双链的HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP，然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。　　2 亲合吸附杂交：生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲合素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗DNA：R ...

Dunn等最早介绍了夹心杂交类型，Ranki等又作了进一步的改进。夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点：①样品不需要固定，对粗制样品能做出可靠的检测；②用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强，因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。　　固相夹心杂交需要两个靠近而不互相重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。样品基因组内核酸只有使这两个探针紧密相连才能形成夹心结构。需注意的是 ...

杂交膜是一种多孔、表面积很大的固相载体，核酸一旦固定在上面，就可用杂交法进行检测。最常使用的膜是硝酸纤维素膜，用于放射性和非放射笥标记探针都很方便，产生的本底浅，与核酸结合的化学性质不是很清楚，推测为非共价键结合。经80℃烤干2h和杂交处理后，核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合，这在使用非同位素探针中尤为有用。硝酸纤维素膜的缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓 ...

组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质 ...

与DNA斑点杂交类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。方法是将RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛）使RNA变性。然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。　　培养细胞，标本处理技术可以简化，不用提取和纯化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低渗缓冲液对多种动物细胞作简单处理，离心去掉细 ...

　　Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧 ...

　　最常用的将克隆重组的DNA片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的DNA可能是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。　　（1）配制下列溶液　　①2×HEPES-缓冲盐溶液（HBS）　　②2mol/L CaCl2　　③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。　　④DNA：将DNA（约20μg/106细胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用浓度为40 ...

（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTApH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。　　（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于DNA从核中释放出来，样品变得粘稠。　　（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37 ...

　　1．DNA的变性　DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用数倍体积的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。热变性在要 ...