化学生物学实验技术

“RNA时代”让我们见识了不断增长的tRNA生物学知识，现在的机械论观点（mechanistic insights）暗示了tRNA的成熟和从细胞核到细胞质的外运（export）过程的内在关联性和复杂性。最近，日本的一些科学家向我们展示了tRNA的亚细胞运输过程（subcellular movement）是一个比想象当中更为复杂的过程。Tohru Yoshihisa和同事们发现，在酵母中，成熟的tR ...

20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿 ...

MicroRNAs是一类非编码蛋白的RNA片段长度大约为22个核苷酸。它是通过结合到目标mRNA上进而抑制该mRNA翻译来起作用的。由此看来，MicroRNAs无论在健康的还是疾病的机体中，都起着中枢调控基因功能的作用。当前，222种人类的MicroRNAs已经被发现：86种通过随机克隆和测序的方法，43种通过计算机的方法，剩下的则是推测的其他生物体中MicroRNAs的类似物。为了验证我们的设想 ...

根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。各种不同的层析方法都涉及共同的基本特点:有一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，而不需要电流。用层析法可以纯化得 ...

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

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基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

此法可加速过滤，并使沉淀抽吸得较干燥，但不宜过滤胶状沉淀和颗粒太小的沉淀，因为胶状沉淀易穿透滤纸，颗粒太小的沉淀易在滤纸上形成一层密实的沉淀，溶液不易透过。循环水真空泵使吸滤瓶内减压，由于瓶内与布氏漏斗液面上形成压力差，因而加快了过滤速度。安装时应注意使漏斗的斜口与吸滤瓶的支管相对。布氏漏斗上有许多小孔，滤纸应剪成比漏斗的内径略小，但又能把瓷孔全部盖没的大小。用少量水润湿滤纸，开泵，减压使滤纸与漏 ...

重结晶是提纯固体物质的一种方法。把待提纯的物质溶解在适当的溶剂中，经除去杂质离子，滤去不溶物后，进行蒸发浓缩到一定程度，经冷却就会析出溶质的晶体。晶体颗粒大小，决定于溶质溶解度和结晶条件，如果溶液浓度较高、溶质的溶解度小，冷却较快，并不断搅拌溶液，所得晶体较小；如果溶液浓度不高，缓慢冷却，就能得到较大的晶体，这种晶体夹带杂质少，易于洗涤，但母液中剩余的溶质较多，损失较大。若结晶一次所得物质的纯度不 ...

常压过滤最为简便和常用，使用玻璃漏斗和滤纸进行过滤。按照孔隙的大小，滤纸可分为快速、中速和慢速3种。快速滤纸孔隙最大。过滤时，把圆形滤纸或四方滤纸折叠成4层（方滤纸折叠后还要剪成扇形）。然后将滤纸撕去一角，放在漏斗中。滤纸的边缘应略低于漏斗的边缘。用水润湿滤纸，并使它紧贴在玻璃漏斗的内壁上。这时如果滤纸和漏斗壁之间仍有气泡，应该用手指轻压滤纸，把气泡赶掉，然后向漏斗中加蒸馏水至几乎达到滤纸边。这时 ...

利用液体混合物中各组分的沸点不同，给液体混合物加热，使其中的某一组分变成蒸气再冷凝成液体，跟其他组分分离，叫做蒸馏。蒸馏一般用于分离沸点相差较大的液体混合物。　 蒸馏操作要注意以下几点：（1）冷凝管的中心线要跟蒸馏烧瓶支管的中心线在同一直线上。在蒸馏烧瓶里放几粒沸石，以防暴沸。蒸馏烧瓶中液体的量是烧瓶容量的1/3～1/2。调整温度计的位置，使水银球的上限恰好处于蒸馏烧瓶支管的下限。（2）蒸馏前冷凝 ...

遗传密码子具有以下基本特点：1）每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸；2)两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以分离，即密码子无逗号;3)密码子具有方向性，例如AUC是Ile的密码子，A为5'端碱基，C为3'端碱基。因此密码也具有方向性，即mRNA从5'端到3'端的核苷酸排列顺序就决定了多肽链中从N端到C端的氨基酸排列顺序;4)密码子有简并性(degeneracy)一种氨基酸有几个密 ...

　　既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那末人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达，想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。　　1.由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计Ⅱ类反义RNA用于和靶mRNASD序列上游区结合，以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。　　2.Ⅲ类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依 ...

用放射性同位素或非放射性化学物质标记探针(待克隆的基因或cDNA的一段同源序列)，同文库的细菌克隆或噬菌斑作核酸分子杂交，经放射自显影或显色反应后，可以筛选出含有同探针互补序列的细菌克隆或噬菌斑，然后分析这些重组载体中所插入的DNA片段或cDNA，最后分离出所要的基因或cDNA。 在克隆cDNA时，还可应用噬菌体载体λgtll构建cDNA文库，这种载体可使插入的cDNA分子翻译产生蛋白质。此 ...

外显子捕捉(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕捉外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体(shuttle vector)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体(见图5—14)。因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicing donor，SD ...

“电子”杂交(electronic hybridization)基本原理同染色体步移是相似的，所不同的只是用EST数据库代替文库，且主要用于全长cDNA克隆。前面已提到EST是长达200bp～300bp的cDNA片段，世界各国的实验室将分离得到的：EST输入一个公开的公共数据库中。如果有了某个cDNA的一个EST后，可输入vEST数据库中去搜索同这个EST有一段共序列的另一个EST，然后把这两个E ...

一、简介：1 细胞质膜资料1895年Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。1925年 Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。1935年 Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。1959年 Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模 ...

外显子扩增(exon amplification) 是以RNA剪接为基础的快速而有效地克隆外显子的方法。所用的载体pSPLl的结构特点是外源片段的克隆位点处在一个内含子序列中，内含子序列的两侧是人免疫缺陷病毒I(HIVl)tat基因的5’剪接位点和3，剪接位点。在剪接位点两侧的序列中含有兔珠蛋白基因的间隔序列2(1VS2)。将待检的DNA片段插入载体所携带的内含子序列中，然后用来转染猴肾细胞系CO ...

原位杂交定位(in situ hybridization) 这是分子水平和染色体水平相结合的基因定位方法。将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录产生的RNA分子作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA中与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可将标记了放射性同位素或非放射性化学物质的探针在染色体上的位置，达到基因定位 ...

纵观当前基因芯片的研究趋势，基因芯片在今后几年内可能的发展方向，可能有以下几个方面：1．进一步提高探针阵列的集成度，如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0×105左右，这样基因数量在1.0×105以下的生物体（大多数生物体）的基因表达情况只用一块芯片即可包括。2 提高检测的灵敏度和特异性。如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标志。多重检测以提高特异性，减少假阳性。 4高自动化、方法趋于标准化 ...