实验基础

将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH,加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min.冷至50~55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%,最终pH应为7.2±0.1.分装于灭菌试管内，放成斜面备用。挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

马尿酸钠培养基：用纯培养物接种，于42℃培养48h,观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液0.8mL,加入三氯化铁试剂0.2mL,立即混合均匀，经10~15min,观察结果。

自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在36±1℃培养4h或18~24h.滴加10%三氯化铁溶液2~3滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。

除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min.

用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20~100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36±1℃培养24h.阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。

蛋白胨水（靛基质试验用）成分蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH7.4制法按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min.靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL.欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL.试验方法挑取小量培养物接种，在36±1℃培养1~2d,必要时可培养4~5d.加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

硫酸亚铁琼脂（硫化氢试验用）成分牛肉膏3g酵母浸膏3g蛋白胨10g硫酸亚铁0.2g硫代硫酸钠0.3g氯化钠5g琼脂12g蒸馏水1000mLpH7.4制法加热溶解，校正pH,分装试管，115℃高压灭菌15min,取出直立候其凝固。试验方法挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于36±1℃培养1~2d,观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。注：肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生，应采用三糖铁琼脂或本培养基。

在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。

营养明胶成分蛋白胨5g牛肉膏3g明胶120g蒸馏水1000mLpH6.8~7.0制法加热溶解、校正至pH7.4~7.6,分装小管，121℃高压灭菌10min,取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8~7.0.试验方法用琼脂培养物穿刺接种，放在22~25℃培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36士1℃培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。

Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）成分蛋白胨2g氯化钠5g磷酸氢二钾0.3g琼脂4g葡萄糖10g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.2制法将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正pH至7.2.加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121℃高压灭菌15min,直立凝固备用。试验方法从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm,于36±1℃培养。

糖发酵管成分牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠3g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.4制法1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min.另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2~3d.迟缓反应需观察14~30d.

ONPG培养基成分邻硝基酚β-D-半乳糖昔（ONPG）60mg（O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10mL1%蛋白胨水（PH7.5）30mL制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1~3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1~3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

西蒙氏柠檬酸盐培养基成分氯化钠5g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g柠檬酸钠5g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mLpH6.8制法先将盐类溶解于水内，校正pH,再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min.放成斜面。试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培养4d,每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。

缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）成分磷酸氢二钾5g多胨7g葡萄糖5g蒸馏水1000mLpH7.0制法溶化后校正pH,分装试管，每管1mL,121℃高压灭菌15min.甲基红（MR）试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36±1℃培养2~5d,哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中，于36±1℃培养2~4d.哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36±1℃下培养4h再进行观察。

克氏柠檬酸盐培养基成分柠檬酸钠3g葡萄糖0.2g酵母浸膏0.5g单盐酸半胱氨酸0.1g磷酸二氢钾1g氯化钠5g0.2%酚红溶液6mL琼脂15g蒸馏水1000mL制法加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min.放成斜面。试验方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36±1℃培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色。

丙二酸钠培养基成分酵母浸膏1g硫酸铵2g磷酸氢二钾0.6g磷酸二氢钾0.4g氯化钠2g丙二酸钠3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH6.8制法先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min.试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。

接种、分离纯化和培养技术：一、接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。1、接种工具和方法。在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图3-3）

微生物常规鉴定技术：形态结构和培养特性观察：1、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

消毒和灭菌两个词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。