抗体抗原实验

二维凝胶电泳质谱技术蛋白质样品的制备 选择正确的样品制备方法是双相电泳实验成功的关键，根据实验设计和研究目的而选择不同的蛋白质样品制备方法。 1．蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则 蛋白质样品制备过程中须遵循的基本原则：①可以重复溶解包括疏水性蛋白质在内的所有蛋白质；②在等电聚焦电泳过程中，避免溶解性低的蛋白质聚积和析出；③减少蛋白质的化学修饰或蛋白质降解；④去除核酸、多糖和 ...

蛋白质点的鉴定 以质谱技术为基础的蛋白质鉴定技术，由于其灵敏度高(可以达到皮摩尔)、速度快、易实现自动化已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。将胶上蛋白质点进行蛋白酶切、回收酶切肽段后，采用MALDI―TOF―MS测定肽质量指纹谱(peptide mapping fingerprint，PMF)，或采用电喷雾串联质谱(ESI―MS―MS)测定肽序列，分别进行数据库检索，实现蛋白质的鉴 ...

二维凝胶电泳质谱技术图像分析 目前主要的二维凝胶电泳专业图像分析软件有BIO―RAD公司的PDQuest 6．0、Amersham Pharmacia Biotech的Image Master 2D Elite和Genomic Solutions开发的Biolmage 2D Investigator等。Image Master 2DElite的操作界面较好，简便易学，且可处理各种来源的ti ...

条件性基因敲除与敲入 在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除―观察整体―推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构 ...

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统 条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控 ...

条件性基因敲除的基本原理Flp／FRT系统 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中．重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点 ...

胚胎干细胞的囊胚注射法构建Cre转基因动物 先将Cre时空特异表达载体线性化，之后用电穿孔等方法将其导人胚胎干细胞中，并以同源重组的方式整合进胚胎干细胞的基因组。这种经过遗传改造的胚胎干细胞再被注入囊胚，最后将胚胎植入假孕母鼠的子宫，使其发育成为一个个体。囊胚注射法的具体步骤如下。胚胎干细胞囊胚注射法构建Cre转基因小鼠示意图 (1)选择合适的载体，将Cre重组酶的编码基因与其重 ...

受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因动物 Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达被置于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然，实现此目标 ...

基于Cre/loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统 该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off(tTA依赖)系统和Tet―On(rtTA依赖)系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子Ptec的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的结合是不需要四环素的，四环素阻碍两者之间的相互作用 ...

条件性基因敲除的策略 条件性基因敲人是在特定的时期、特定的组织和器官中使某个基因获得表达，可用于研究致病基因的功能或者构建在特定的条件下、特定的组织和器官中表达某个基因的转基因动物模型。其基本原理和实施方法与前面介绍的条件性基因敲人非常相似，只不过在构建loxP转基因动物时，靶基因与启动子之间含有一段具有翻译终止密码的基因序列，导致靶基因不能正常翻译。而这段分割序列的两侧各有一个loxP位 ...

条件性基因敲除应用于研究基因的功能 层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质中的一个重要成分，在调节细胞的生长和功能方面发挥重要的作用。层粘连蛋白是一个异源三聚体，由α、β和γ亚基构成。之前的研究表明，层粘连蛋白功能的缺陷可以导致肌肉营养失调和外周神经髓鞘形成障碍。全身性层粘连蛋白基因的缺失可以导致胚胎在胚胎发育第5天即发生死亡，因此用传统的基因缺失方法无法研究层粘连蛋白基因在外周神经系统 ...

致病基因的条件性敲入，构律人类某些疾病的动物模型 利用Cre／loxP系统进行条件性基因敲人的原理与基因敲除的原理非常相似，区别只是在事先想要研究的基因编码区内引入一段翻译终止序列，并且该终止序列的两侧具有两个同向的loxP位点。在没有Cre重组酶的组织和器官中，由于翻译终止序列存在致病基因是没有活性的，在某些特定的组织器官中，当Cre重组酶出现时会导致终止序列的丢失，从而使致病基因激活， ...

基因敲除到总结和展望 经典的基因敲除将靶基因在所有的组织器官中终生灭活，这就导致许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brcal、Brca2、Dpc4/Smad4等，在敲除后引起小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatio tempora ...

条件性基因敲除应用于追踪细胞的发育命运 在胚胎发育过程中，特定器官的出现以及特定类型细胞的分化是按照细胞内的程序有条不紊地进行的，研究这些细胞的分化及迁移，对于阐明个体的发生过程、探讨某些疾病的发生机制非常重要。在研究过程中，一般会选择一种或多种特定细胞的分子标志来标记相应细胞的分化、运动以及形态的变化。但是检测这些分子标志的一般方法如RT-PCR或原位杂交等不能提供连续、动态的报告，而基 ...

噬菌怖肽库技术用于分析蛋白质的抗原表位 蛋白质的抗原表位即该蛋白质在参与抗原-抗体反应中直接与特异性抗体结合的氨基酸序列和构象。研究蛋白质的抗原表位对于了解蛋白质的结构与功能、分子识别的基础是十分重要的，也为多肽药物的筛选、疾病新型诊断抗原以及多肽疫苗的研制提供重要的依据和线索。 目前广泛用于蛋白质抗原表位的分析方法主要是肽扫描，即按照蛋白质氨基酸的序列，合成多个线形的重叠肽，再利 ...

噬菌怖肽库技术的发展历史 1982年，Dulbecco首先提出一种创造性的设想，他认为可以将病原体的抗原与入噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合并表达在其表面，这种表面表达有病原体抗原的病毒颗粒可以作为疫苗，由此第一个提出了表面展示(display)的概念并申请了美国专利。1985年，Smith首次证实了丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程技术进行这种改造，他将EcoRI核酸内切酶的部分基因片段 ...

肽库的概念和分类 肽库(peptidelibraries)是大量特定长度且序列不同的小肽的集合，它包括了该长度短肽中各种(或绝大部分)氨基酸序列的排列组合。 肽库最早是Geyson及其同事在1986年提出的，他们认为：①蛋白质分子之间的结合或识别主要是由局部肽段上数个氨基酸残基间的相互作用来完成的，这些氨基酸之间形成非共价键联系；②有些多肽虽然其序列与抗原的天然表位不同，但在结合抗体 ...

丝状噬菌体的生活史 野生型Pf类丝状噬菌体只能感染带有F性菌毛的雄性大肠杆菌。当噬菌体感染大肠杆菌时，先通过其头部的pⅢ蛋白N端吸附于大肠杆菌F性菌毛的末端，脱去主要衣壳蛋白pⅧ，其感染性单链DNA则进入宿主细胞细菌，并在10～15min内，首先在宿主胞内酶的作用下，以此环状单链的DNA为正链，通过滚环复制拷贝出互补的负链DNA，形成环状双链DiNA分子即复制型DNA(RFDNA)。这种双 ...

噬菌怖肽库技术在新型药物设计中的应用 传统药物的开发一般是从自然界的动物、植物和微生物中分离出具有特定药理作用的化学物质或蛋白质(多肽)，然后对于化学物质(一般是作为药物研究的先导化合物)再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。目前大部分药物是通过这些方法获得的，但此方法往往周期长、风险高、耗资巨大，并带有很大的 ...

噬菌怖肽库技术用于发展新型诊断抗原和疫苗 噬菌体肽库技术可以用于筛选疾病特异性抗原表位，在疾病的诊断、治疗以及新型疫苗的研制方面具有广泛的应用前景。感染或曾经感染过某种病原体的患者，其血清中往往存在有相应的病原体特异性抗体，临床上可以通过检测这些抗体来知道患者感染的状况。常规检测这些抗体的方法需要有诊断抗原，而这些抗原通常是纯化的病原体天然抗原或者是通过基因工程技术表达和纯化的重组抗原。但 ...