蛋白质技术

荧光能量共振转移 （FRET）检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，广泛应用于生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等。原理当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在 10nm 范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即 FRET 现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。应用1、生物大分子结构和功能研究：细胞膜 ...

自体吞噬是细胞中一种降解和再生细胞组分的基本细胞过程，词语「autophagy」源自希腊词语「auto-」和吞噬（phagein），前者意思是「自我」(self)，而后者的意思则是「去吃」，而自噬表示的就是「自己把自己吃掉」（self eating）；自体吞噬这种概念是 20 世纪 60 年代提出来的，当时科学家们首次观察到细胞能够通过将自身内容物裹入到膜结构中来破坏内容物，从而形成袋装的囊泡结构，这种囊泡结构能够被运输到再循环小泡结构中进 ...

膜蛋白的重要性不言而喻，假如细胞膜是守护细胞的城墙，而膜蛋白就是站在城墙上的各司其职的士兵，肩负着把守城门、传递信号、运输物质等重要职责。膜蛋白 一旦“失守”，就会造成细胞功能紊乱，进而引起组织和器官发生病变，使身体遭受病痛侵扰。这也就是为什么膜蛋白成为大多数重要的药物研究对象和靶点。在人体蛋白中，有大约30%是膜蛋白，ＦＤＡ批准的新药中，绝大多数都以膜蛋白为靶点，几乎所有的膜蛋白都是研究热点。然而让人吃惊的是，乐观估计 ...

人体的胰腺并非仅在进餐时脉冲式分泌胰岛素，而且是全天保持着相对平稳的的工作状态，这种持续、非进餐时的胰岛素分泌被称为基础胰岛素，对稳定血糖意义重大。每日基础和餐时血糖和胰岛素水平变化的曲线如下图：我们可以清晰地看到，血液中的胰岛素（蓝色实线）含量并非一根一直保持不动的直线，而是在三餐前后有着明显的增加。实际上，胰岛素水平灵敏的响应着体内血糖水平的变化（红色实线），从而能够在饭前饭后协助血糖水平的稳定。在这种灵敏响 ...

一般单次剂量的注射剂通过灭菌的方法即可达到无菌，而对于采用低温灭菌、滤过除菌或无菌操作法制备的注射剂或多剂量包装的注射剂，均应在处方中添加适宜的抑菌剂，以防止在制造、贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染。抑菌剂具有抑制微生物细胞生长的能力，其过剂量也可能对人体有一定的安全性隐患，所以在注射剂处方中，抑菌剂的用量既要能抑制注射液中微生物的生长，又要求对人体无毒、无害。而对于加有抑菌剂的注射剂，仍要用适宜方法除菌， ...

6xHis 标签，也称为多组氨酸标签， His6 标签或 hexa 组氨酸标签, 是一种在转染的细胞中目标蛋白的 C 端或 N 端上由至少 6 个组氨酸残基链接上所组成的氨基酸序列。这种标签通常在重组蛋白的纯化中使用，这是因为组氨酸残基的序列可以在特定的缓冲液条件下结合到几种类型固定的离子上（比如镍，钴和铜）从而达到容易检测和纯化 His 标签蛋白的目的。由于它的相对小的分子量，低的免疫原性，亲水性和在去污剂和其他添加剂存在的情况下的易变性, 因此在天然和变性的条件下 ...

蛋白样品制备中，在细胞破碎之后，既可以利用特定蛋白质的特性来分离某一类蛋白质，比如亲和纯化，比如前面介绍的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一个考虑方向是去除杂质----去掉样品中某些非目标高丰度蛋白或者杂质的干扰，同样可以达到简化样本的目的。当然要小心「倒洗脚水的时候别把婴儿也倒掉了」，一定要选择可靠的产品。比如，潜在疾病标志物的最好样本来源就是血清或其他体液，此类样本可以提供人蛋白质组中绝大部分组份。然而用蛋 ...

小课堂又要开始啦话说label-free这个蛋白质组学方法实在是有些尴尬。这个方法有可能是进入组学研究以来方法的鼻祖，现在却面临着不大受待见的境地。不管是从pubmed上搜索关键词还是从项目结果中统计，使用label-free的项目数量远低于使用label的定量蛋白质组学研究，如现在仍很火热的iTRAQ、有后起之秀态势的TMT、或者有高实验要求的SILAC。今天我们不谈为什么label-free远没有iTR ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。深圳子科生物技术部主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：一、 原理与 Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二 ...

Q：SDS－PAGE 电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4 g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K ...

膜蛋白具有许多重要的细胞功能，对生物体存在至关重要。他们具有超过 60% 的药物靶点，占细胞总蛋白的 20%-30%。膜蛋白包括完整的膜蛋白，跨膜蛋白和外周膜蛋白。膜蛋白或者附着在脂质双分子层上或者通过疏水，离子或其他非共价与膜周边的完整蛋白结合。 使用表面活性剂进行质膜蛋白分离有可能破坏蛋白质-蛋白质相互作用，改变膜蛋白的拓扑结构。在一些下游应用中，例如膜蛋白 IP，Co-IP，酶检测，质谱分析实验，使用无表面活性剂的方法分离质膜蛋白 ...

从培养的细胞和组织中提取总蛋白是实验室非常常见的实验步骤，从大多数类型的细胞和组织中提取总蛋白比较容易，但是从脂肪组织中提取高质量和高浓度蛋白质是非常困难的。脂肪组织有白色和棕色脂肪两种类型，被称为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。脂肪组织中含有许多脂滴，蛋白质含量小于细胞总数的 2%。低蛋白含量使得从脂肪中分离高浓度蛋白极具挑战性。以下是几种从脂肪组织中提取蛋白的方法：A.RIPA 缓冲液提取法：脂肪组织 ...

在 WB 和 IP 实验中，破碎细胞或组织与选择和配制裂解液一样重要。比起一些更软的组织（如脑组织），在准备 WB 或 IP 的样品时，紧密的纤维组织（如肌肉组织）需要更剧烈的方法；对于培养的原代细胞或细胞系，在准备 WB 和 IP 的样品时需要一定的机械搅拌去提取蛋白。机械破碎样品常规的方法和设备如下：组织高速匀浆仪通常破碎体积大的植物或者动物组织需要用可旋转、带有刀片的匀浆仪或者搅拌器 .这些仪器通常通过一个电动的马达带动不锈钢可旋转切割刀片，可以从顶部或者 ...

提高酶稳定性是改造酶在高温等极端条件下行使其活性理想的设计步骤，同时也能降低酶对蛋白酶剪切的敏感性。由于这些优点，研究者已经发明了很多不同的方法和技术改造蛋白质，但到目前为止这些方法的效果很有限。这里，我们介绍包括末端截切、随机突变和断裂、重组、再延长，然后在生理温度下筛选，以期获得稳定性提高的酶活突变体。以 TEM-1β-内酰胺酶为模型蛋白，通过三轮酶的定向进化，包括随机突变、DNA 混编以及在 37℃ 下的筛选，得到了其体内氨苄抗性与野生型相当的有删截的突变体。动力学研究表明，筛选到的突变体与其野生型相比有显著的热稳定性。这种方法非常有效，进化所产生的酶能够在比野生型的最适温度高 20°C 的条件下，保持其最高的酶活反应。因此在生理温度下通过末端截切和接下来作为补偿的定向进化来干扰结构，是提高蛋白质热稳定性的快速、高效的方法，避免了在高温下筛选的需要。

蛋白质工程领域主要涉及关于设计新的酶活性或折叠，以及理解蛋白质正确折叠和稳定的最基本的序列决定因素。迄今，已有巨大的精力投入到设计构建多肽文库方法的研究中。最常用的方法是用来筛选具有高亲和力的特异性结合蛋白的噬菌体展示技术。本章讲述了一种可替代噬菌体展示的方法，该方法是基于二氢叶酸还原酶（DHFR)蛋白质片段互补检测（PCA)建立起来的，可以完全用于体内实验。我们以筛选 raf 蛋白的 ras 结合结构域（ras-binding domain，RBD)正确折叠且能于 ras 结合所需的简并序列为例，讲述 DHFR PCA 的应用。此筛选系统通过重复的竞争实验，富集文库中表现最好的序列，而无需将体外实验所必需的文库筛选和扩增步骤分离。而且，可以在 96 孔板中通过三乙酸基氮（ nitrilotriacetic acd，NiNTA)亲和层析直接快速处理被选中的克隆。此方法特别适用于设计和筛选研究序列折叠和结合决定因素的文库。另外，将该方法略加修改，还可以应用于文库间的筛选，从而可以使相互作用的蛋白质实现共同进化。

分隔式自我复制（CSR)是蛋白酶，特别是聚合酶，定向进化的一种新方法。在 CSR 最简单形式中，它包括一个简单的环路反馈，即聚合酶只复制编码自身的基因 (自我复制）。自我复制发生在一个热稳定的油包水乳化液形成的离散、分离、没有交互的空间中。分隔保证了表型和基因型之间的正确联系（也就是说，分隔保证了聚合酶只复制编码自身的基因而与空间外的成分没有关系）。这样，聚合酶特性的改进直接转化到编码该聚合酶的基因信息的扩增上。CSR 被证明在聚合酶的定向进化上是一个很有用的方法。在本章，我们描述了一些有用的 CSR 的实验方法，这些方法成功地利用一个 Tag 聚合酶随机突变库，使 Poll(Tag) 聚合酶性质得到了改变，如增加了热稳定性以及对潜在抑制剂（肝素）的抵抗能力。

在这里我们介绍一种在体外将基因型和表现型相联系的新策略，用来选择功能蛋白质。这个策略里，蓖麻蛋白的 A 链在翻译时被激活，因此不需要去掉终止密码子，就能形成核糖体、信使 mRNA 和翻译出蛋白质的稳定复合物。这个技术不需要转染、化学合成、连接，也不需要去掉终止密码子。因此，我们的新型核糖体失活展示系统能够为体外蛋白质的进化提供一个可靠的、简单的、完全的筛选系统，而不损失种群库，这样将随机和适度选择策略综合应用的方法，可以预测进化方向。

本章描述了改进融合蛋白在 M13 噬菌体颗粒表面展示水平的一个方法。向 M13 衣壳锚定蛋白引入突变后，蛋白质展示水平约能增加两个数量级。这里讲述改进蛋白质展示水平的噬菌体展示库的设计、构建以及筛选方法。

蛋白酶生化性质的改善可以通过对该酶基因的错掺突变和 DNA 混编方法实现。混编技术可用于同一基因的一组突变体，或者对相关家族基因的片段进行新的组合，产生嵌合突变基因产物。但该方法有一个缺点，就是在混编重组过程中，突变库中会存留大量并未发生重组的（“亲本”）片段。现在，我们可以通过设计简并引物，利用简并寡核苷酸基因改组方法来提髙发生重组基因的产量，减少未重组“亲本”基因的产量。在实验过程中，该方法既可避免混编前使用核酸内切酶将基因切成片段，又对基因特定片段进行随机突变。这里我们详细描述了这种方法如何应用于不同 GC 含量的 β-木聚糖酶家族基因。

利用 DNA 混编模仿自然进化过程是优化 DNA 和蛋白质性质的常用方法。这里我们介绍这类方法的一个新进展，即利用标准的聚合酶链反应（PCR)放大基因文库时与其他 4 种标准 dNTP—起掺入 dUTP 作为确定 DNA 碎裂位点的交换核苷酸。掺入的尿嘧啶碱基可用尿嘧啶-DNA-糖基化酶切除，随后 DNA 主链用哌啶切开。这个寡聚核苷酸库的重组装由内引物延伸步骤及高保真聚合酶来增加产率，最后由 PCR 扩增。变性聚丙烯酰胺尿素凝胶电泳表明这个方法可以产生大小可调的 DNA 片段，大小范围取决于 dUTP :dTTP 比率。对于一个模式蛋白，氯霉素乙酰转移酶I( CAT )，利用包含 33% dUTP 的 PCR 产生的混编基因库测序显示了大约 0.1% 的低突变率，并且，在没有进行片段分离的情况下，平均 亲本片段大小为 86 个碱基。因此，核苷酸交换和剪切技术（NExT) DNA 混编可重复性好并且容易实行，使之优于相应同类技术。另外，NExT 碎裂的结果可以利用计算机软件，NexTProg 预测出来。