简介
双抗体夹心法是检测可溶性抗原最常用的方法，要求待检测抗原是大分子抗原，且具备多个不同的或者相同的抗原表位，能分别被双抗体识别和结合。
常用于乙型肝炎表面抗原（HBSAg）、癌胚抗原（CEA）、细胞因子及Ig同种型检测等。
原理
双抗体夹心法检测抗原的基本原理是将抗原特异性单克隆抗体（capture antibody）包被在固相载体表面，与受检标本中的抗原结合。
再加酶标单克隆抗体（detectionantibody），形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，酶催化底物出现有色产物。结合标准品测定可对受检标本中的抗原进行定量分析。
材料与仪器
器材：
微量加样器、高结合力酶标反应板、酶标仪等。
试剂：
①0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH9.5（Na2CO31.59 g＋NaHCO32.93 g溶于双蒸水至1000 ml）。
② 0.01 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4。
③封闭液（5％ 脱脂乳-PBS，pH7.4）。
④洗涤液（0.05％ Tween20-PBS，pH7.2）。
⑤样本稀释液（0.05％ Tween20-1％ BSA-PBS溶 液，pH 7.4）。
⑥辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体。
⑦OPD溶液：
①磷酸盐-柠檬酸缓冲液：pH5.0（柠檬酸7.3g＋Na2HPO4•2H2O 11.86 g溶于双 蒸水至1000 ml）。
②OPD底物溶液：10 mg OPD加入25 ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，完全溶解后，于用前加入5 μl30％ H2O2（V／V）。
注意：OPD溶液不稳定，应避光保存；OPD有致癌性报道，操作时须戴手套。
⑧TMB 溶液：将2.5 mg TMB溶于250 μl DMSO后加磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH6.0至25 ml，使用前加入5 μl 30％ H2O2（V／V）。
TMB无致癌性报道，有商品化TMB显色液销售。
⑨终止剂（1 mol／L H2SO4）600 ml双蒸水中，缓慢滴加浓硫酸100 ml，并不断搅拌，双蒸水补足至900 ml。
步骤
双抗体夹心法检测抗原的基本过程可分为如下几步：
A抗体包被（capture Ab） 用包被液（0.05 mol／L碳酸盐缓冲液，pH9.5或pH7.2 PBS，根据蛋白活性选择包被液）将抗体稀释至0.2～10 μg／ml，100 μl／孔，4 ℃过夜。
B洗板 弃去孔内溶液，吸水纸拍干，洗涤液洗3次，每孔大于250 μl，每次静置1分钟。
C封闭 加封闭液250 μl／孔，室温，静置1小时。
D洗板 重复步骤2。
E加样 用样本稀释液梯度稀释待检样品和标准品，100 μl／孔，室温，静置2小时；或4 ℃过夜（增加敏感性）。
F洗板 重复步骤2。
G加酶标抗体（detection Ab） 用样本稀释液稀释酶标抗体（使用前），100 μl／孔，室温，静置2小时。
H洗板 重复步骤2，洗板次数可增加至5次。
I加底物显色 加TMB底物溶液100 μl／孔，室温避光，静置5～15分钟。
J终止反应 加入1 mol／L H2SO4,50 μl／孔，振荡数秒混匀。
K结果判定
（1）定性：直接用肉眼观察结果，TMB经HRP催化后变为蓝色，加酸后转为黄色。反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
（2）定量：用酶标仪测定每孔在450 nm处的光吸收值。
（A450 mm），以标准品浓度为横坐标，标准品孔A450 mm值为纵坐标，绘制标准曲线，从而求出待检样品中抗原浓度。
来源：丁香实验
