其他实验

本章描述基于灭活H V J (hemagglutinating virus of J a p a n, 日本血凝病毒，又称Sendaivirus, 即仙台病毒）融合介导载体的构建技术。 H V J 脂质体由含D N A 的融合脂质体和灭活的H V J 组成；H V J 包装载体则是一种更为简单的载体，它 将 D N A 直接包装到灭活H V J 中而形成，不需要脂质体的参与。作者：T.弗里德曼等,

本章描述纳米脂质颗粒（N L P ) 包封核酸的详细实验步骤。这种 N L P 带有聚乙二醇(P E G ) 屏蔽层，并含有生物敏感脂质和配体，用于实施D N A 的靶向输送。与传统的阳离子脂质-D N A 复 合 物 （Iipoplex) 不同，上述N L P 通过乙醇透析法获得，并在围绕D N A 分子的脂质双分子层中掺入了 P E G 化脂质，颗粒直径小于l〇〇 n m 。作者：T.弗里德曼

基 因 治 疗 研 究 的 核 心 在 于 合 适 传 输 体 系 的 研 发 。尽 管 目 前 大 多 数 临 床 实 验 使 用 的 都是 病 毒 载 体 体 系 ，但 是 ，阳 离 子 脂 质 体 由 于 其 具 有 安 全 性 以 及 多 样 性 的 特 点 ，使 其 成 为具 有 广 泛 应 用 前 景 的 基 因 载 体 。病 毒 载 体 可 能 引 起 遗 传突 变 以 及 癌 变

电转染可用于基因功能、启动子活性和基因调控的研究，它还可用于建立转基因或基因敲除胚胎干细胞，以及传递编码R N A 的肿瘤抗原到树突状细胞中，用于肿瘤疫苗的研究。电转染也可将治疗基因传递到免疫细胞中用于肿瘤治疗，或将治疗基因传递到干细胞中用于不同类型疾病的治疗作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

借助 一 种 鸡 胚 电 穿 孔 的 新 技 术 ，成 功 地 将 基 因 导 入 到 胚 胎 中 。与 之 相反 ，由 于 哺 乳 动 物 的 胚 胎 被 母 体 的 子 宫 包 围 ，在 发 育 的 大 多 数 阶 段 ，用 传 统 的 办 法 在 宫内 特 定 区 域 对 哺 乳 动 物 胚 胎 的 遗 传 操 纵 变 得 十 分 困 难 ，甚 至 根 本 不 可 能 。针 对 这 一 难点

利用 D N A /磷 酸 韩 （C a P O 4) 共沉淀的方法来转染细胞是一个被广为描述的方法。虽然这种共沉淀法在3〇多年前就已经被提出了（G r a h a m and van der E b 1973),但至今实验室中仍在广泛应用，这主要是因为它相对于其他转染方法而言具有明显的优点。相对于商业化的转染试剂盒，这种方法所需要的试剂便宜，可以用于各种已建立的细胞系 （包括贴壁和不贴壁细胞系）

为了实现靶基因的转运，对慢病毒载体做了两类表面修饰：①利用其他病毒的定向性，结合异源病毒糖蛋白（称之为假型）；②异源的多肽与病毒糖蛋白融合使得慢病毒颗粒能重新靶向感兴趣的细胞。本章提供一个提升慢病毒载体组织靶向性的新颖的方法，以及一个靶向转导造血干细胞( H S C ) 的示例方案。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

为了提髙转导效率，一个叫假型形成的策略被采纳了，它是将反转录病毒颗粒与其他病毒编码的外壳蛋白相结合。因为这些假型载体颗粒用了不同的表面受体进人细胞，与含有原始的反转录病毒外壳蛋白的载体相比，它们能更有效地把转基因运输进哺乳动物细胞。如果受体有严格的组织分布，那么依靠外壳蛋白，它们也能够进行组织专一性的运输。这里，我们采用了水泡性口炎病毒（V S V ) 的糖蛋 白 （G ) 来说明如何在几天之内产

泡 沫 病 毒 （F V ) 或 spumavirus，是作为整合型病毒载体发展的非病原的反转录病毒。 F V 载体几个潜在的优势包括广宿主范围、强大的包装能力，以及稳定的包含双链D N A 的整合前复合物。 F V 对于干细胞，包括各种造血干细胞的转导尤其高效作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

由于其遗传的简单性，噬菌体通常用于治疗性基因转移的载体遗传性优化方法中。另外，由于噬菌体的繁殖是菌株特异性的，因此不同宿主对于遗传改造、修饰甚至对用遗传筛选来进行产量、遗传稳定性、制备和花费的优化都是同等适合的。靶向配体的选择确定了靶向噬菌体转导的特异性。由于蛋白质可以有效地被表达，并且在被分泌到细菌胞质外周空间和进入噬菌体颗粒后具有生物学活性，因此遗传靶向主要限制在蛋白质上 。作者：T.弗里德曼

α病毒强烈的嗜神经元特性，使其在神经生物学研究中特别有用。但不幸的是， α病毒对宿主细胞强烈的细胞毒性作用、相对短期的瞬时表士模式'以及相当高的病毒产物消耗，都是其缺点。然而，新的突变α病毒显示出了低毒性及长期表达的优点。尤其是高产量的膜蛋白（通常在重组系统中很难有较高水平的表达）有益于在结构生物学上的应用。《病毒也可以用于疫苗开发和基因治疗。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因

小 R N A 病毒包括一大群小的、无荚膜的、正义单链R N A 病毒。小 R N A 病毒的生活周期很快，完全在细胞质内进行，而不需要整合到宿主细胞的基因组或经历一个核相。由于它们在生物学和遗传学上的局限性，其在通常的基因转移上的应用受到了限制。然而，它们可能适于作疫苗载体。此外，小 R N A 病毒介导的多种报道基因或者外源 R N A 元 件 （foreign R N A d e m e n

组织特异性和血管生成相关的受体的功能血管图谱已经被较广泛地推广，并通过分离受体、细胞系、实验动物模型的筛选技术、体内外临床样品和直接用于患者的样品的分离技术进行了优化。最近，一类新的配体指导的腺相关病毒（A A V ) 和噬菌体杂交的受体已经被设计出来，用于以全身投递的方式可达到的细胞表面受体进行靶基因的转移。最终，这些进展可应用于临床。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

本章将会讨论昆虫来源的杆状病毒展示载体的设计及其潜在的用途。建立展示库的一般步骤和这些基因递送载体的特性也将会在本章中进行阐述。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

杆状病毒已经成为在真核细胞中表达重组蛋白质的标准工具。数千种胞内和分泌的蛋白质已经在昆虫细胞中成功表达。改造过的杆状病毒能够转导分裂的和不分裂的脊椎动物细胞，从而进一步扩大了杆状病毒表达载体系统（BEVS) 的应用范围。这就为通用的表达方法提供了基础，能通过一步克隆允许目的基因在一些不同类型的宿主中表达 。最近的发现证明杆状病毒能可以在哺乳动物中介导有效地基因递送。因为作为非哺乳类病毒，这类病毒无

感染了杆状病毒的草地贪夜蛾（Sf9 ) 昆虫细胞的细胞核提取物编码猿猴病毒40(S V 4 0 ) 的主要外壳蛋白（V P l )。在 有 M g C l 2、 CaCl2 和 A T P 存在时，这些核提取物能包装超螺旋结构的质粒D N A 或 R N A 干 扰 （R N A i ) 序列，从而在体外形成S V 40假病毒体。这种包装方法和其他病毒或非病毒传递系统相比有许多优点。特别是它拥有广

本章讲述了如何利用无辅助病毒包装体系来构建H S V /A A V 杂合载体，同时也讨论了其与传统的H V S /AAV扩增子载体相比的优点和缺点。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

本章讲述了如何利用无辅助病毒包装体系来构建H S V /A A V 杂合载体，同时也讨论了其与传统的H V S /AAV扩增子载体相比的优点和缺点。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

松猴疱疼病毒（H V S ) 可以高效地感染多种人体细胞。它的基因组是环状、多拷贝的非整合游离基因，可以在细胞分裂的时候分离，产生子代病毒。这种特性使得基于H V S 而构建的载体可以稳定转导处于分裂期的细胞群，且可以使导人的基因在体内或体外维持较长时期稳定地表达。此外，还可以在松猴疱疹病毒（H V S ) 基因组中插人细菌人工染色体（B A C ) 表达框，这简化了大片段异源性D N A 的转导

通过辅助病毒来感染病毒制造细胞的克隆，含 有 和 基 因 的 稳 定 的 病 毒 制 造细胞系和r A A V (重组腺联病毒）载 体 为 r A A V 储存库的建立提供了一个可靠而有效的程序。然而，这一类细胞系的建立耗时较久。因此，只有在需要大量的rAAV时才推荐使用这种方法，如在大量动物体上进行的临床前研究等。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」